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过表达天山雪莲SikCDPK1基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探 被引量：4
1
作者 田晓涵 庞学兵 +1 位作者 祝建波 朱新霞 《中国烟草学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第6期98-103,共6页
钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)在植物参与非生物胁迫信号响应中发挥着重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲钙依赖性蛋白激酶基因Sik CDPK1在-4℃低温胁迫处理下的表达量,发现低温胁迫... 钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)在植物参与非生物胁迫信号响应中发挥着重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲钙依赖性蛋白激酶基因Sik CDPK1在-4℃低温胁迫处理下的表达量,发现低温胁迫可以诱导天山雪莲内源Sik CDPK1基因表达,且在处理3 h表达量迅速积累达到最高值。将Sik CDPK1基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pCAMBIA2300上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,发现转基因烟草植株在低温胁迫后,耐低温能力明显增强;脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均高于非转基因烟草植株;丙二醛含量和相对电导率均低于非转基因烟草植株。上述研究结果表明,SikCDPK1基因可以通过积累渗透调节物质、增强抗氧化酶活性和维持细胞膜稳定性来提高植物的耐低温能力。 展开更多
关键词 天山雪莲 sikcdpk1基因 低温 表达分析 转基因
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雪莲SikCDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性分析 被引量：2
2
作者 刘玉玲 朱新霞 +1 位作者 吕新华 孙辉 《草业学报》 CSCD 北大核心 2023年第9期213-221,共9页
极端生境草本植物天山雪莲中的Sik CDPK1基因可明显提高转基因烟草的低温、干旱耐受性。为探究Sik CDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性,本研究利用实时荧光定量PCR技术检测了Sik CDPK1基因在雪莲不同组织器官的表达水平以及对信号分子Ca... 极端生境草本植物天山雪莲中的Sik CDPK1基因可明显提高转基因烟草的低温、干旱耐受性。为探究Sik CDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性,本研究利用实时荧光定量PCR技术检测了Sik CDPK1基因在雪莲不同组织器官的表达水平以及对信号分子CaCl_(2)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA_(3))、水杨酸(SA)、H_(2)O_(2)的诱导响应模式,采用Kinase-GloTM技术检测了SIKCDPK1蛋白激酶活性,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因融合蛋白表达法进行了SIKCDPK1蛋白的亚细胞定位。结果显示:Sik CDPK1基因在雪莲根、茎、叶、种子、幼茎、幼叶中均表达,Sik CDPK1基因受CaCl_(2)、ABA、GA_(3)、SA、H_(2)O_(2)的诱导表达但响应模式有差异;激酶活性分析发现Ca^(2+)存在时,SIKCDPK1具有激酶催化活性,加入Ca^(2+)螯合剂EGTA后,SIKCDPK1几乎没有激酶活性。SIKCDPK1激酶活性随Ca^(2+)浓度增加而增加,Ca^(2+)浓度(K0.5)为48.7 nmol·L^(-1)时,SIKCDPK1激酶活性可达到最大活性的1/2;以HisⅢ为底物时,SIKCDPK1的Km值可达到43.8μg·m L^(-1),SIKCDPK1蛋白定位于细胞核。上述结果表明Sik CDPK1基因表达无明显组织特异性,可响应信号分子Ca^(2+)、ABA、GA_(3)、SA、H_(2)O_(2)的诱导;SIKCDPK1发挥蛋白激酶活性需要Ca^(2+),SIKCDPK1主要在细胞核里发挥作用。 展开更多
关键词 sikcdpk1基因 表达 蛋白激酶活性
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雪莲SikCDPK1启动子的克隆和活性分析 被引量：3
3
作者 史光珍 王兆晔 +1 位作者 孙琦 朱新霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期191-197,共7页
旨在克隆雪莲(Saussurea involucrata)SikCDPK1 启动子并分析其活性,为进一步解析雪莲 SikCDPK1基因的转录调控机制奠定基础。通过TAIL-PCR技术从雪莲中克隆SikCDPK1启动子,利用PlantCARE分析启动子区顺式作用元件,构建全长启动子或5’... 旨在克隆雪莲(Saussurea involucrata)SikCDPK1 启动子并分析其活性,为进一步解析雪莲 SikCDPK1基因的转录调控机制奠定基础。通过TAIL-PCR技术从雪莲中克隆SikCDPK1启动子,利用PlantCARE分析启动子区顺式作用元件,构建全长启动子或5’端缺失启动子驱动的GUS重组表达载体 P0∷GUS、P1∷GUS、P2∷GUS和P3∷GUS,转入根癌农杆菌中进行瞬时转化试验,通过GUS组织化学染色分析不同长度启动子的活性,分别测定低温和干旱胁迫下的GUS酶活。结果显示,获得了1 042 bp的SikCDPK1启动子序列,pSikCDPK1具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还含有多个与逆境、激素、光响应等相关的顺式作用元件。转化的烟草叶片经GUS染色之后均显蓝色,启动活性依次为P0>P1>P2>P3,低温、干旱处理后GUS酶活性发生变化。SikCDPK1启动子被成功克隆,具有驱动下游报告基因表达的活性。 展开更多
关键词 雪莲 sikcdpk1启动子 GUS活性 瞬时表达
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启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响 被引量：1
4
作者 刘玉玲 王梦瑶 +2 位作者 孙琦 马利花 朱新霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期168-175,共8页
探究逆境诱导启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响,为SikCDPK1基因在植物遭遇低温、干旱时更好发挥作用奠定基础。采用基因重组技术构建RD29A启动子驱动SikCDPK1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法遗传转化烟草,分别观... 探究逆境诱导启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响,为SikCDPK1基因在植物遭遇低温、干旱时更好发挥作用奠定基础。采用基因重组技术构建RD29A启动子驱动SikCDPK1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法遗传转化烟草,分别观察、测定和比较分析低温、干旱处理后,RD29A::SikCDPK1转基因烟草、35S::SikCDPK1转基因烟草和非转基因烟草的表型、POD活性、SOD活性、叶绿素含量、MDA含量和相对电导率的差异。结果显示,干旱和低温胁迫后,RD29A::SikCDPK1转基因烟草的生长状况优于35S::SikCDPK1转基因烟草,更优于非转基因烟草;同时,RD29A::SikCDPK1转基因烟草的POD活性、SOD活性、叶绿素含量显著高于35S::SikCDPK1转基因烟草,极显著高于非转基因烟草;但MDA含量与相对电导率显著低于35S::SikCDPK1转基因烟草,极显著低于非转基因烟草。表明启动子RD29A可通过减缓叶绿素降解速率、提高抗氧化系统酶活性、减小膜通透性,使转基因烟草表现出更强的干旱、低温耐受性。 展开更多
关键词 雪莲sikcdpk1基因 RD29A启动子 转基因 干旱 低温 耐受性
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SikCDPK1基因EF-hand的定点突变、原核表达及蛋白纯化 被引量：1
5
作者 郭家秀 朱新霞 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2023年第2期503-509,共7页
钙依赖性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPK)通过与Ca^(2+)相互作用,在植物响应各种逆境胁迫的过程中发挥重要作用,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca^(2+)的关键结构。为进一步研究具有极强耐寒性的天山... 钙依赖性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPK)通过与Ca^(2+)相互作用,在植物响应各种逆境胁迫的过程中发挥重要作用,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca^(2+)的关键结构。为进一步研究具有极强耐寒性的天山雪莲对逆境的响应机制,本研究采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因EF-hand基序的第435、第471、第507和第540位氨基酸分别由E(谷氨酸)突变为Q(谷氨酰胺),构建定点突变原核表达载体,转化表达菌株E.coli BL21(DE3),使用IPTG诱导蛋白表达,利用亲和层析系统对重组蛋白进行纯化。结果显示,重组菌株能够成功表达出目的重组蛋白,重组蛋白可溶性表达量较高的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h,最后成功纯化出符合预期大小的可溶性蛋白,为进一步探究SikCDPK1中不同EF-hand基序的生物学功能提供了实验依据。 展开更多
关键词 sikcdpk1 EF-HAND 定点突变 原核表达 蛋白纯化
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