SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立 被引量：8

1

作者 陈辉 金辉 +4 位作者 杜春艳 顾鹏宇 王纯耀 张钦宪 高翔 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期699-702,共4页

目的构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型。方法从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H+-K+ATPaseβpromoter/SV40T,通过显微注射... 目的构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型。方法从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H+-K+ATPaseβpromoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况。结果将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%。在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠。除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠。8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76)。RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达。不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在。结论建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型。 展开更多

关键词 sv40t抗原 SOUTHERN BLOTTING 定位表达 转基因小鼠

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SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探 被引量：2

2

作者 王鹰 邓军 +2 位作者 郝飞 杨希川 钟白玉 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期627-630,共4页

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分... 目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。 展开更多

关键词 CRE/LOXP系统 sv40t抗原 黑素细胞 永生化 可逆性

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SV40T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性 被引量：3

3

作者 宋红芹 孙怀昌 +1 位作者 许益民 王宝安 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2003年第4期203-207,共5页

目的　建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系。方法　根据已发表的SV4 0病毒T基因序列设计引物 ,以整合有SV4 0DNA早期基因区的COS 1细胞基因组DNA为模板 ,用高保真PCR扩增SV4 0T基因。将获得的SV4 0T基因克隆... 目的　建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系。方法　根据已发表的SV4 0病毒T基因序列设计引物 ,以整合有SV4 0DNA早期基因区的COS 1细胞基因组DNA为模板 ,用高保真PCR扩增SV4 0T基因。将获得的SV4 0T基因克隆入真核表达载体 ,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞。经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆 ,对其生物学特性进行研究。结果　扩增出序列正确的SV4 0T基因 ,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第 4天 ,细胞群体倍增时间为 2 3 5h ,克隆形成率为2 6 7%。DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV4 0T基因 ,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常 ,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤 ,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长。部分细胞克隆已在体外传 30代以上 ,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征 ,在胶原基质上能形成腺泡样结构。结论　本研究获得的SV4 0T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性。 展开更多

关键词 猴病毒40T基因 山羊 乳房 上皮细胞 生物学特性 sv40t基因

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SV40T抗原基因永生化新生大鼠前软骨干细胞株的构建 被引量：2

4

作者 胡伟华 郭风劲 +2 位作者 张树威 陈安民 丁然 《医药导报》 CAS 2007年第5期460-464,共5页

目的建立永生化大鼠前软骨干细胞(PSCs)株,为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用L ipofectam ineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达,... 目的建立永生化大鼠前软骨干细胞(PSCs)株,为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用L ipofectam ineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养,观察细胞形态及生长状况,绘制细胞生长曲线,用免疫细胞化学方法和RT-PCR鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。结果分离获得转化细胞阳性克隆,用免疫组化证实FGFR-3表达阳性,提取RNA后用RT-PCR法成功扩增出588 bp的片段。转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞。贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端分离、培养出前软骨干细胞,pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。 展开更多

关键词 sv40t 前软骨干细胞 细胞培养 永生化

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SV40T外显子的拼接及逆转录病毒载体pLLTSN的构建 被引量：3

5

作者 李俊刚 陈耀凯 王宇明 《世界华人消化杂志》 CAS 2004年第5期1104-1107,共4页

目的:为构建肝细胞永生化载体,对猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)外显子进行拼接并以其为外源片段构建逆转录病毒永生化载体pLLTSN. 方法:以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T的2个外显子,重叠延伸拼接法将两个外显子拼接到一起,... 目的:为构建肝细胞永生化载体,对猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)外显子进行拼接并以其为外源片段构建逆转录病毒永生化载体pLLTSN. 方法:以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T的2个外显子,重叠延伸拼接法将两个外显子拼接到一起,然后用双粘端连接法将其克隆到空载体pLXSN 的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间,通过菌落PCR和酶切法筛选,鉴定阳性克隆并经DNA测序验证. 结果:拼接成2.1 kb的SV40T,用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中4个为阳性,均含有2.1 kb SV40T插入片段.经质粒DNA测序分析的阳性克隆,确证无内含子. 结论:获得重组的2.1 kb无内含子的SV40T,成功构建了逆转录病毒载体pLLTSN. 展开更多

关键词 sv40t外显子 逆转录病毒 载体pLLTSN 肝细胞 抗原

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两种含SV40T不同区段的基因构建及其转基因小鼠的建立 被引量：1

6

作者 谢夏阳 滕勇 +3 位作者 孙强 徐平 孙怀昌 李厚达 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2005年第1期27-32,共6页

目的　为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法　利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4... 目的　为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法　利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4 0T基因片段克隆测序 ,最终将这两个改造后的基因克隆进乳腺特异性的真核表达载体p2 0 5C3中 ,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠。结果　利用PCR方法检测出 6只双阳性转基因 (同时检测到SV4 0T DRb和SV4 0T Dp5 3两种基因 )小鼠 ,为避免检测结果中假阳性的发生 ,应用Southern blot方法检测出 1只双阳性转基因小鼠。结论　本试验的结果证明 ,构建的两种含SV4 0T不同区段的策略是成功的 ,其建立的阳性转基因小鼠确实是弱化了SV4 0T转基因小鼠高发瘤的特性。 展开更多

关键词 转基因小鼠 sv40t基因 PCR 肿瘤模型 DNA肿瘤病毒

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SV40T/LoxP等外源性基因修饰与肝细胞永生化的研究 被引量：1

7

作者 李炜 余卫业 +5 位作者 姚思敏 张振宇 李美中 傅佳鹏 黄华 王平 《江西医药》 CAS 2008年第7期656-659,共4页

目的构建永生化肝细胞系,观察其生长状态及检测其相关生物免疫学特性。方法拟利用基因重组克隆方法构建含有SV40T、EGFP基因片段以及LoxP序列,插入Cre基因片段,采用脂质体转染法将新载体pSV-GFP-Cre-LOX转染至来源于成人原代供肝细胞,... 目的构建永生化肝细胞系,观察其生长状态及检测其相关生物免疫学特性。方法拟利用基因重组克隆方法构建含有SV40T、EGFP基因片段以及LoxP序列,插入Cre基因片段,采用脂质体转染法将新载体pSV-GFP-Cre-LOX转染至来源于成人原代供肝细胞,建立新型肝细胞体系进行细胞培养;利用转化肝细胞能够表达绿色荧光蛋白特性观察该体系中转化肝细胞的生长状况,最后通过系列生化免疫反应检验转化肝细胞的生化免疫学特性;通过Cre重组酶定点切割导入的SV40T基因使转化肝细胞回复到永生化前的状态,并检测其细胞学相关特性。结果转染SV40T基因的肝细胞具备正常肝细胞生物学特性,且增殖较快,体外易培养。结论新建永生化肝细胞系可以为进一步肝细胞移植提供理想细胞材料作出研究基础。 展开更多

关键词 永生化 肝细胞 基因 sv40t

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小鼠MEF/Hsf1^(-/-)/Hsf1细胞系的重建及Hsf1,SV40T-ag蛋白的表达

8

作者 蒋杞英 张智 +2 位作者 胡延忠 王明丽 马远方 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1218-1223,共6页

目的:重建热休克转录因子1(Heat shock transcription factor 1,Hsf1)过表达的MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系,为进一步研究Hsf1的功能提供实验模型。方法:将携带Hsf1全长基因的逆转录病毒载体pWZL-blast-flag-Hsf1,通过瞬时转染的方法,转染产... 目的:重建热休克转录因子1(Heat shock transcription factor 1,Hsf1)过表达的MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系,为进一步研究Hsf1的功能提供实验模型。方法:将携带Hsf1全长基因的逆转录病毒载体pWZL-blast-flag-Hsf1,通过瞬时转染的方法,转染产生病毒的小鼠包装细胞293Phoenix。用病毒上清直接感染MEF/Hsf1-/-细胞,建立Hsf1稳定表达的MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系。通过Western blot实验,检测Hsf1和SV40T抗原(T-antigen,T-ag)蛋白的表达。结果:Hsf1蛋白在MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞中的表达比WT/MEF细胞强,而在MEF/Hsf1-/-细胞中没有明显表达。SV40T-ag蛋白在MEF/Hsf1-/-细胞中的表达明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞强,而SV40T-ag蛋白在WT/MEF细胞中的表达强于MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞。结论:成功建立了MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系;Hsf1参与了对SV40T-ag蛋白的表达调控。 展开更多

关键词 热休克转录因子1 sv40t抗原 转染 逆转录病毒载体 小鼠胚胎成纤维细胞

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脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的研究

9

作者 成钢 董文君 +2 位作者 吴侠 李淑红 王京仁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期786-792,共7页

采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠胚胎成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,经过G418培养基加压筛选,定期观测每孔阳性克隆出现的时间、数量及生长状态;比较不同胎龄或日龄、细胞接种密度、传代次数、脂质体剂... 采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠胚胎成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,经过G418培养基加压筛选,定期观测每孔阳性克隆出现的时间、数量及生长状态;比较不同胎龄或日龄、细胞接种密度、传代次数、脂质体剂量对脂质体介导的SV40T基因转染东方田鼠胚胎和皮肤两种成纤维细胞效率的影响。结果显示,两种细胞的阳性克隆约在15 d后出现,随着胎龄或鼠龄的增加,阳性细胞克隆在数量和增殖程度上有减少和减慢的趋势;以接种密度为1×104/孔的胚胎和皮肤成纤维细胞转染和筛选效果最好,细胞克隆增殖最快,数量最多;随着传代次数的增加,细胞克隆转染和筛选效果变差;在其他条件一致的情况下,以1 L/孔脂质体使用剂量,阳性克隆出现的时间早、克隆数量多、生长状态好。 展开更多

关键词 东方田鼠 成纤维细胞 脂质体 sv40t抗原 转染

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不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平测定

10

作者 申琦 邵蓓新 +2 位作者 郜十伟 陈辉 张钦宪 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2010年第6期929-930,共2页

目的:检测不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平。方法:取已建立的8个品系SV40T转基因小鼠和B6小鼠空腹血,应用ELISA法检测血浆胃泌素水平。结果:B6小鼠、2#、4#、16#、24#、51#、57#、61#和73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平(μg/L)... 目的:检测不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平。方法:取已建立的8个品系SV40T转基因小鼠和B6小鼠空腹血,应用ELISA法检测血浆胃泌素水平。结果:B6小鼠、2#、4#、16#、24#、51#、57#、61#和73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平(μg/L)分别为(2.814±0.209)、(1.135±0.114)、(0.853±0.701)、(2.371±0.335)、(1.371±0.190)、(0.685±0.374)、(2.274±0.251)、(2.471±0.251)和(0.986±0.173),9组相比,差异有统计学意义(F=17.449,P<0.001);其中2#、4#、24#、51#及73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平较B6小鼠明显降低(P<0.05)。结论:筛选出了5个稳定表达的SV40T转基因小鼠品系。 展开更多

关键词 sv40t抗原 胃泌素 转基因小鼠

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转基因重组质粒ATP4B-SV40T-IRES-GFP的构建及鉴定

11

作者 张隆 赵成根 +3 位作者 李大力 王金玉 李琦 范忠泽 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2012年第4期314-318,共5页

目的:构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒并进行鉴定.方法:根据小鼠ATP4B启动子序列设计引物,获得的小鼠ATP4B基因启动子序列,并加入限制性内切酶酶切位点.将其装入载体IRES-GFP,获得重组载体ATP4B-IRES-GFP并进行酶切鉴定.之后将SV40T... 目的:构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒并进行鉴定.方法:根据小鼠ATP4B启动子序列设计引物,获得的小鼠ATP4B基因启动子序列,并加入限制性内切酶酶切位点.将其装入载体IRES-GFP,获得重组载体ATP4B-IRES-GFP并进行酶切鉴定.之后将SV40T基因克隆入ATP4B-IRES-GFP载体,并用限制性内切酶PstI和AseⅠ进行验证.结果:将小鼠ATP4B启动子序列插入IRES-GFP载体,经过酶切验证获得正确的ATP4B-IRES-GFP质粒;将SV40T片段插入ATP4B-IRES-GFP,质粒测序及酶切结果验证获得正确的ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒.显微注射入小鼠受精卵可获得阳性小鼠.结论:成功构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒,可用于下一步构建原发性胃癌转基因小鼠. 展开更多

关键词 sv40t ATP4B启动子 质粒 转基因小鼠

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SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

12

作者 陈辉 马慧洁 +2 位作者 张艳 乐晓萍 张钦宪 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2008年第2期231-234,共4页

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定。方法:扩增小鼠H+/K+ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK;从含有SV40T基因的pLITAg质粒... 目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定。方法:扩增小鼠H+/K+ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK;从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定。用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达。结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达。结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功。 展开更多

关键词 sv40t抗原 胃癌 真核载体

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SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

13

作者 陈辉 杜春艳 +2 位作者 谢庆瑞 马慧洁 张钦宪 《山东医药》 CAS 北大核心 2008年第26期39-41,共3页

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定。用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况。结果限制性... 构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定。用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况。结果限制性内切酶分析与测序结果示H+/K+ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性。认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础。 展开更多

关键词 sv40t抗原 转染 真核载体

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脂质体介导SV40T基因构建东方田鼠成纤维细胞永生系技术体系的建立

14

作者 成钢 汤志宏 +2 位作者 董文君 李淑红 王京仁 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第2期231-233,共3页

为了优化脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的条件,提高其转染效率,试验采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠成纤维细胞中,经过G418培养基加压筛选、阳性细胞克隆的筛选及扩大培养、永生化细胞中S... 为了优化脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的条件,提高其转染效率,试验采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠成纤维细胞中,经过G418培养基加压筛选、阳性细胞克隆的筛选及扩大培养、永生化细胞中SV40T基因的整合与表达检测、永生系细胞生长曲线测定等步骤,成功构建了东方田鼠成纤维细胞永生系。结果表明:采用SV40T基因单导入的方法,可成功构建东方田鼠成纤维细胞永生系。 展开更多

关键词 东方田鼠 成纤维细胞 脂质体 sv40t抗原 转染

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SV40T基因转染黑素细胞遗传稳定性研究 被引量：1

15

作者 常海 邓军 +3 位作者 杨希川 郝飞 钟白玉 叶庆佾 《实用医院临床杂志》 2008年第3期24-26,共3页

目的探讨SV40T抗原基因转染构建的永生化黑素细胞的遗传稳定性。方法体外培养黑素细胞,对第20代的永生化黑素细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析细胞增殖情况,同时分析染色体核型,流式细胞仪分析细胞周期和DNA倍体;逆转录-聚合酶链... 目的探讨SV40T抗原基因转染构建的永生化黑素细胞的遗传稳定性。方法体外培养黑素细胞,对第20代的永生化黑素细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析细胞增殖情况,同时分析染色体核型,流式细胞仪分析细胞周期和DNA倍体;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析第20代细胞hMLH1、hMSH2错配修复基因表达,并提取细胞基因组,微卫星位点PCR产物进行变性聚丙烯酰胺电泳分析微卫星不稳定性。结果经过连续培养的第20代转染的黑素细胞左旋多巴染色阳性,增殖速度较原代培养黑素细胞明显增快,细胞周期S+G2期细胞比例较原代黑素细胞增多,同时未见异常DNA倍体,染色体仍为2倍体,转染细胞的hMLH1、hMSH2错配修复基因表达较正常黑素细胞上调;在1p22(D1S187)、5q14(D5S107)、18q12.2-12.3(D18S34)3个位点未出现微卫星不稳定性(m icrosatellite instab ili-ty,M I)。结论SV40T抗原基因转染的黑素细胞体外培养不出现遗传稳定性的异常改变。 展开更多

关键词 sv40t基因 黑素细胞 错配修复基因 微卫星不稳定性

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SV40T基因对绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖的影响 被引量：1

16

作者 汪林丽 艾越 +3 位作者 王梦瑶 张效生 连正兴 韩红兵 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2021年第10期89-95,共7页

本研究旨在通过SV40T基因导入来提高绵羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的体外传代次数,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究奠定基础。采用酶促分离获得原代绵羊EECs和ESCs,并用携带SV40T基因的慢病毒以MOI 1:10和MOI 1:50感染并... 本研究旨在通过SV40T基因导入来提高绵羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的体外传代次数,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究奠定基础。采用酶促分离获得原代绵羊EECs和ESCs,并用携带SV40T基因的慢病毒以MOI 1:10和MOI 1:50感染并进行单克隆细胞株筛选。结果表明,所得EECs和ESCs分别具有上皮和基质细胞典型特征(上皮细胞呈铺路石状,基质细胞呈梭形)并表达特异性标记蛋白细胞角蛋白(Cytokeratin)和波形蛋白(Vimentin);EECs传至约50代,ESCs传至约30代后,光学形态观察、SV40T基因表达、标记蛋白免疫荧光及血清依赖性检测结果表明两类细胞形态未发生变化,均表达SV40T基因,并具有上皮细胞特性和基质细胞特性,伴有较强的血清依赖性,证实成功建立了EECs和ESCs细胞株;生长曲线和SV40T基因拷贝数检测结果显示ESCs的增殖能力要强于EECs,MOI 1:10和MOI 1:50感染下,SV40T基因拷贝数差异不显著。以上结果提示,SV40T基因能够大大增强绵羊EECs和ESCs体外增殖能力并延长其寿命,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究提供了素材。 展开更多

关键词 sv40t 绵羊 子宫内膜上皮细胞 子宫内膜基质细胞

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纯合子胃壁细胞特异性表达SV40T抗原转基因小鼠品系的建立

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作者 郜十伟 刘书漫 +3 位作者 陈辉 李倩茹 金辉 张钦宪 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2010年第6期939-942,共4页

目的:建立稳定遗传的纯合子SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠品系。方法:通过定量PCR法比较已知杂合子小鼠和未知阳性小鼠中外源基因的起始模板量来确定小鼠的基因型,并通过测交的方法来验证试验结果。结果:用定量PCR法选育出15只纯合... 目的:建立稳定遗传的纯合子SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠品系。方法:通过定量PCR法比较已知杂合子小鼠和未知阳性小鼠中外源基因的起始模板量来确定小鼠的基因型,并通过测交的方法来验证试验结果。结果:用定量PCR法选育出15只纯合子小鼠,经测交验证它们与野生型小鼠交配所生的后代均为阳性,证明了定量PCR的结果是正确的。通过纯合子之间的全同胞交配建立了6个独立的纯合子品系。结论:定量PCR具有省时、省力及高通量等优点,能够很好地应用于筛选纯合子转基因动物。 展开更多

关键词 sv40t 转基因 基因型 胃壁细胞 小鼠

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SV40T促进施旺细胞重编程为间充质干细胞 被引量：1

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作者 生立平 李瑞芳 +3 位作者 鄢艳红 杨娟 胡晴 葛林通 《基础医学与临床》 CSCD 2019年第10期1417-1422,共6页

目的鉴于施旺细胞(SCs)在外周神经损伤修复中发挥关键作用,本研究旨在通过猿猴病毒40大T抗原(SV40T)建立永生化的小鼠坐骨神经施旺细胞系及探讨其分化潜能。方法通过MPH 86质粒转染小鼠坐骨神经SCs,然后使用潮霉素筛选细胞并传代培养,... 目的鉴于施旺细胞(SCs)在外周神经损伤修复中发挥关键作用,本研究旨在通过猿猴病毒40大T抗原(SV40T)建立永生化的小鼠坐骨神经施旺细胞系及探讨其分化潜能。方法通过MPH 86质粒转染小鼠坐骨神经SCs,然后使用潮霉素筛选细胞并传代培养,将转染SV40T的SCs指定为SV40T-SCs。利用WST-1检测细胞增殖,并通过qPCR分析细胞SV40T及神经标志物的表达情况。将SV40T-SCs进行免疫组织化学染色。最后,在体外诱导SV40T-SCs进一步分化。结果SV40T-SCs的细胞形态多样,增殖迅速,可以永续传代,与原代SCs显著不同。SV40T-SCs高表达Nestin、Pax3和Slug。免疫组织化学染色显示CD44、CD73和CD105阳性。另外,SV40T-SCs在体外可被诱导分化为骨细胞和脂肪细胞。结论SV40T可能诱导小鼠坐骨神经SCs发生重编程作用,使SCs转化成为间充质干细胞(MSCs)。 展开更多

关键词 施旺细胞 sv40t 永生化 重编程 间充质干细胞

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SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定

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作者 谢永华 王冠明 许秀秀 《生物技术世界》 2016年第5期28-30,共3页

目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALB>SV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病... 目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALB>SV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下进行滴度值测定。用SV40T慢病毒载体转染肝癌Hep G2细胞,并在荧光显微镜下行转染效率测定;实时荧光定量PCR检测转染细胞SV40T基因的表达水平。结果 Gateway技术构建的慢病毒载体p LV-Puro-ALB>SV40T经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为1.73×108 TU/m L。慢病毒载体成功转染Hep G2细胞,转染效率约70%,并通过RT-PCR检测SV40T表达水平明显升高。 展开更多

关键词 肝细胞 sv40t 抗原 慢病毒

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携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定 被引量：2

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作者 毕杨 何昀 +4 位作者 黄佳祎 张琴 王瑜伟 赵迎泽 冯涛 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2008年第4期303-308,共6页

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基... 目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。 展开更多

关键词 自杀基因 SV40 T抗原 肝细胞永生化 Cre/loxP位点特异性重组系统

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