SV40-LT基因的原核表达及免疫原性检测

1

作者 付玉志 李传峰 +3 位作者 陈宗艳 王超 陈铁桥 刘光清 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第2期208-212,共5页

为了获得纯化的SV40-大T抗原(SV40-LT)及其特异性抗体,本研究利用原核表达系统高效表达了SV40大T抗原的高抗原指数区域,然后将纯化的大T抗原免疫试验兔,制备了相应的特异性抗体。经蛋白免疫电泳和ELISA方法检测,结果表明本研究获得的原... 为了获得纯化的SV40-大T抗原(SV40-LT)及其特异性抗体,本研究利用原核表达系统高效表达了SV40大T抗原的高抗原指数区域,然后将纯化的大T抗原免疫试验兔,制备了相应的特异性抗体。经蛋白免疫电泳和ELISA方法检测,结果表明本研究获得的原核表达产物,不仅具有较好的免疫原性,而且能够诱导试验兔产生较高的抗体水平(抗体效价为1∶6 400)。 展开更多

关键词 sv40-lt基因 原核表达 特异性抗体 ELISA

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SV40-LT基因使牙髓干细胞永生化的研究 被引量：2

2

作者 陈冬雪 白喜龙 梁英民 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期189-193,共5页

目的:分离牙髓干细胞,用含有SV40-LT抗原的慢病毒感染牙髓干细胞以建立永生化细胞株并进行鉴定。方法:消化法获得牙髓干细胞;用慢病毒粒子HBLV-SV40LT-3*flag-PURO感染目的细胞,抗生素筛选出稳定传代的细胞株,并进行干性测定。结果:原... 目的:分离牙髓干细胞,用含有SV40-LT抗原的慢病毒感染牙髓干细胞以建立永生化细胞株并进行鉴定。方法:消化法获得牙髓干细胞;用慢病毒粒子HBLV-SV40LT-3*flag-PURO感染目的细胞,抗生素筛选出稳定传代的细胞株,并进行干性测定。结果:原代与永生化的牙髓干细胞(iDPSCs)在分化能力及表面标记物的检测无差异;Real-time PCR结果显示,感染组细胞中SV40-LT基因的转录水平显著提高;Western blot结果显示,实验组均可检测到标签蛋白Flag的表达。结论:含有SV40-LT基因片段的慢病毒可使人牙髓干细胞发生永生化,永生化后的细胞仍具有多向分化潜能。 展开更多

关键词 牙髓干细胞 永生化 sv40-lt

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MDCK过表达SV40-LT基因稳定细胞系的构建

3

作者 刘文凯 田玲 +3 位作者 乔自林 王家敏 王明明 李铀 《甘肃畜牧兽医》 2021年第12期54-58,共5页

细胞永生化使细胞能够在保持遗传性状的同时无限增殖,细胞的体外永生化需要将HPV的E6和E7基因、SV40的LT基因或人端粒酶逆转录酶(hTERT)等导入目标内,而SV40-LT是建立永生化细胞最便捷的基因。本试验利用慢病毒感染方式将SV40-LT导入MDC... 细胞永生化使细胞能够在保持遗传性状的同时无限增殖,细胞的体外永生化需要将HPV的E6和E7基因、SV40的LT基因或人端粒酶逆转录酶(hTERT)等导入目标内,而SV40-LT是建立永生化细胞最便捷的基因。本试验利用慢病毒感染方式将SV40-LT导入MDCK细胞中,阳性筛选后经qPCR和免疫荧光实验均检测到SV40-LT的表达,成功建立了利用慢病毒方式导入SV40-LT的实验体系,为后续永生化细胞建系研究提供了技术依据。 展开更多

关键词 增殖 MDCK sv40-lt 细胞永生化

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人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞 被引量：5

4

作者 张思春 余乐 +1 位作者 李素 涂长春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期87-91,共5页

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选... 为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。 展开更多

关键词 猪血管内皮细胞 人端粒酶催化亚基 sv40 LT 永生化

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SV40 LT抗原介导的蝙蝠胎儿肾细胞永生化 被引量：1

5

作者 张思春 杨凡力 +2 位作者 余乐 何彪 涂长春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期363-366,共4页

蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞... 蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞。利用重组逆转录病毒转导法将SV40 LT抗原基因转导入蝙蝠胎儿原代肾细胞,经嘌呤霉素筛选获得LT基因整合和表达的阳性细胞,并进行连续传代培养。RT-PCR和western blot检测表明转导的细胞中有SV40 LT基因的整合和表达。转导细胞在软琼脂中培养不能够形成克隆,表明其未发生癌性转化。对第33代的转导细胞进行单细胞克隆,获得了3个衍生的细胞系,其中Mp-Ki03细胞系已培养至第60代。病毒感染试验表明蝙蝠西江病毒和蝙蝠轮状病毒均可以感染该转导细胞系。本研究通过SV40 LT抗原建立了永生化的蝙蝠胎儿肾细胞系,并且该细胞系对蝙蝠病毒易感,对分离与鉴定蝙蝠病毒以及研究病毒感染蝙蝠细胞的机制具有重要的作用。 展开更多

关键词 蝙蝠 肾细胞 sv40 LT抗原 永生化

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树鼩骨骼肌卫星细胞系的建立及生物学特性研究

6

作者 罗丽莹 柯盛辉 +2 位作者 覃万钊 班晓羽 何光耀 《医学理论与实践》 2025年第20期3421-3426,3437,共7页

目的:通过慢病毒转染猿猴病毒40的大T抗原(SV40-LT)基因建立稳定表达SV40-LT的树鼩原代骨骼肌卫星细胞(SMSCs)模型,为永生化细胞建系研究奠定基础。方法:实验利用慢病毒转染SV40-LT基因成功建立永生化SMSCs模型,通过多项实验对细胞进行... 目的:通过慢病毒转染猿猴病毒40的大T抗原(SV40-LT)基因建立稳定表达SV40-LT的树鼩原代骨骼肌卫星细胞(SMSCs)模型,为永生化细胞建系研究奠定基础。方法:实验利用慢病毒转染SV40-LT基因成功建立永生化SMSCs模型,通过多项实验对细胞进行鉴定并验证其生物功能特性。转染后的细胞在形态上与原代细胞基本一致,且具有较高的SMSCs细胞纯度和稳定SV40-LT蛋白表达。结果:永生化SMSCs具有更快的增殖能力和细胞活力,且无明显的细胞衰老表现。血清依赖性分析、软琼脂分析结果及染色体核型分析均表明永生化SMSCs未发生恶性转化。然而,在诱导分化模型中,转染后的SMSCs未能形成明显的肌管结构,与原代细胞有所不同。结论:本研究成功构建了慢病毒转染SV40-LT基因,成功建立稳定表达SV40-LT的树鼩原代SMSCs模型,不仅探究了建立成熟永生化实验体系的过程,而且提高了树鼩原代SMSCs的增殖能力和细胞活力,为永生化细胞建系研究提供了技术依据。 展开更多

关键词 树鼩 骨骼肌卫星细胞 sv40-lt基因

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原代及转化的人血管内皮细胞模型的建立

7

作者 冯海凉 孔令华 +3 位作者 代伽茵 杨振丽 卞晓翠 刘玉琴 《基础医学与临床》 2025年第12期1600-1607,共8页

目的建立原代及猿猴病毒40(SV40)T抗原转化的人血管内皮细胞模型,为内皮研究提供可利用资源。方法分别分离培养人脐静脉内皮细胞、人脐动脉内皮细胞、大隐静脉内皮细胞、子宫内膜及肝癌旁组织中内皮细胞,利用含有SV40大T、小t抗原的慢... 目的建立原代及猿猴病毒40(SV40)T抗原转化的人血管内皮细胞模型,为内皮研究提供可利用资源。方法分别分离培养人脐静脉内皮细胞、人脐动脉内皮细胞、大隐静脉内皮细胞、子宫内膜及肝癌旁组织中内皮细胞,利用含有SV40大T、小t抗原的慢病毒进行转化,体外连续传代培养,通过RNA测序分析转化前后内皮细胞转录组差异。对转化后的内皮细胞,流式细胞术检测CD31的表达,PCR法进行种属鉴定及支原体检测,短重复序列谱(STR)检测鉴定细胞身份。转化后脐血管内皮进行人类白细胞抗原(HLA)检测,并且通过慢病毒感染及集落筛选的方式建立Cas9稳定表达的脐静脉内皮细胞。结果建立了187株转化人脐静脉内皮细胞、1株转化脐动脉内皮细胞、5株转化大隐静脉内皮细胞、1株子宫内膜来源转化内皮细胞及1株肝组织来源转化内皮细胞、9株稳定表达Cas9蛋白的单集落脐静脉内皮细胞株。188株脐带来源转化血管内皮细胞中CD31阳性率≥90%为168株,另20株阳性率在20%~90%。5株转化大隐静脉细胞CD31阳性细胞比例分别为93%、76%、93%、50%和96%。RNA测序证明转化后内皮细胞增殖能力(包括周期调控、DNA复制合成等)通路改变且在体外培养过程具有稳定性。转化后内皮细胞种属鉴定为人源性,STR结果与原代一致且具有唯一性,无支原体的污染,国家生物医学实验细胞资源库已收藏并可提供共享服务。结论建立了一系列原代及SV40 T抗原转化的人血管内皮细胞模型,为心血管疾病、炎性反应、肿瘤及免疫相关疾病研究提供基础。 展开更多

关键词 血管内皮细胞 人脐静脉内皮细胞 sv40 大T抗原 CD31 Cas9

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大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现 被引量：3

8

作者 毛德文 裴燕燕 王明刚 《大众科技》 2017年第12期35-37,共3页

枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联。Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍。课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_p ... 枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联。Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍。课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_p Lenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达。将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性。 展开更多

关键词 KUPFFER细胞 sv40-lt片段 永生化 特性

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正常大肠干细胞的条件永生化 被引量：4

9

作者 朱永良 钟献 郑树 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2004年第5期379-384,共6页

目的 :建立正常人大肠干细胞系。方法 :用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞 ,以含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒感染 ,对其进行永生化 ;然后 ,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定。结果 :... 目的 :建立正常人大肠干细胞系。方法 :用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞 ,以含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒感染 ,对其进行永生化 ;然后 ,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定。结果 :用中性蛋白酶分级消化获得的 AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形。该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒后 8～ 12周出现上皮样细胞克隆 ,经细胞特性鉴定 :PAS染色黏蛋白阳性 ,上皮细胞角蛋白 pan、CK- 8、CK- 19均阳性 ;用 EL ISA- PCR法检测该细胞第 12代和第 4 3代端粒酶活性 ,分别为 0 .4 3、0 .83;用 Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和 SV4 0大 T抗原 ;用 RT- PCR检测示该细胞株表达 Musashi- 1m RNA;以 1× 10 6细胞数接种裸鼠 ,观察 4个月无肿瘤形成 ,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现。结论 :建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征 ,可作为体外研究致癌剂 展开更多

关键词 大肠干细胞 端粒酶逆转录酶 sv40大T抗原 细胞 培养的

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PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

10

作者 陆琤 周晨辰 +2 位作者 张鹏飞 张硌 查玉华 《中国医学装备》 2017年第9期167-170,共4页

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞... 目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。 展开更多

关键词 PLEKHQ1基因敲除小鼠 骨髓来源巨噬细胞 永生化 sv40LT抗原

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鸡骨骼肌卫星细胞系的建立及分析 被引量：1

11

作者 王燕星 张雨时 +7 位作者 姬海港 刘阳 牛玉芳 韩瑞丽 刘小军 田亚东 康相涛 李转见 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期4972-4981,共10页

旨在通过慢病毒包装SV 40-LT基因并转导PMSCs以构建鸡骨骼肌卫星细胞系。本研究采集20~30枚15胚龄健康AA鸡的胸部组织,采用混合酶消化法分离培养PMSCs。将细胞随机分为两组,每组3个重复,处理组选择SV 40-LT慢病毒转染48 h后,更换含1μg&... 旨在通过慢病毒包装SV 40-LT基因并转导PMSCs以构建鸡骨骼肌卫星细胞系。本研究采集20~30枚15胚龄健康AA鸡的胸部组织,采用混合酶消化法分离培养PMSCs。将细胞随机分为两组,每组3个重复,处理组选择SV 40-LT慢病毒转染48 h后,更换含1μg·mL^(-1)的嘌呤霉素筛选培养基于处理组和对照组(病毒不转染)。待对照组细胞全部死亡,对处理组细胞进行不断传代培养,最终获得鸡骨骼肌卫星细胞系。免疫荧光试验分析鸡骨骼肌卫星细胞标志基因PAX7的表达;采用CCK-8和细胞周期分析检测细胞增殖特性;血清依赖性和软琼脂分析检测其恶性转化情况;构建诱导分化模型检测其诱导分化能力。结果表明,PMSCs中有92%细胞PAX 7基因呈阳性,可用于后续研究。SV 40-LT基因在鸡骨骼肌卫星细胞系(IMSCs P12)中的表达是原代鸡骨骼肌卫星细胞的15倍,且连续传代至12代后,IMSCs P12与PMSCs均呈纤维样状。IMSCs P12具有更高的增殖活性且没有发生恶性转化,随后,对IMSCs P12进行诱导分化,在其增殖至70%到诱导分化1 d这一阶段,IMSCs P12与PMSCs的PAX 7基因表达下调,而MyoD和MyHC基因表达上调。结果提示,本研究通过转染SV 40-LT基因成功培养了鸡骨骼肌卫星细胞系,其具有与原代鸡骨骼肌卫星细胞相似的特性。该细胞系的建立为研究家禽骨骼肌相关的功能基因提供了新的平台,也为SV 40-LT基因在家禽细胞永生化的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 鸡 骨骼肌卫星细胞 sv 40-lt 细胞系 PAX 7

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LSL-Cas9小鼠永生化胚胎成纤维细胞系的构建及应用

12

作者 张言 包明月 +5 位作者 韩冰 田梦园 杨亚娜 冯晨昱 李星 张媛 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期42-52,共11页

目的:利用猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高... 目的:利用猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高效验证。克服由于Cas9序列过大而引起的转染效率低的问题,构建一种用于sgRNA剪切效率验证的经济、便捷、高效工具。方法:以LSL-Cas9胎鼠为实验动物,分离其MEF并感染SV40 LT慢病毒;利用潮霉素筛选成功转化的细胞;通过免疫荧光检测成纤维细胞标志物表达和细胞衰老情况,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定SV40 LT抗原基因在MEF中的整合情况,建立永生化无限增殖细胞系;以IL10Rα基因为例验证该系统的可行性:设计4种sgRNA,利用含有PU6-sgRNA串联PCSP-Cre基因表达盒的质粒转化永生化LSL-Cas9小鼠MEF系;通过T7内切核酸酶I(T7 endonuclease I,T7EI)法评估sgRNA的剪切效率,挑选靶向性最优的sgRNA。结果:经潮霉素筛选的阳性细胞扩大培养并稳定传代至60代,具备永生化无限增殖细胞系的特点;经PCR鉴定,SV40 LT抗原基因已稳定整合至MEF基因组中;T7EI酶切法证实sgRNA有效引导Cas9内切核酸酶实现了靶基因的切割,4种sgRNA的基因编辑效率分别为28.17%、45.87%、33.61%、38.62%。结论:SV40 LT抗原基因介导的永生化无限增殖LSL-Cas9 MEF系构建成功,可实现sgRNA引导Cas9剪切效率的高效快速验证。 展开更多

关键词 LSL-Cas9转基因小鼠 永生化细胞系 sv40 LT抗原 T7EI

原文传递

永生化羔羊睾丸细胞的建立及应用

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作者 于浩洋 王彩霞 +4 位作者 吴绍强 仇松寅 刘晓飞 冯春燕 林祥梅 《中国动物传染病学报》 2026年第1期158-166,共9页

旨在建立永生化羔羊睾丸细胞(lamb testis,LT),为山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)疫苗等的疫苗研发及分子生物学研究提供有力的工具。研究采用酶消化法分离原代LT细胞,利用慢病毒载体分别包装含有hTERT和SV40-LT基因的两种重组慢病毒,... 旨在建立永生化羔羊睾丸细胞(lamb testis,LT),为山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)疫苗等的疫苗研发及分子生物学研究提供有力的工具。研究采用酶消化法分离原代LT细胞,利用慢病毒载体分别包装含有hTERT和SV40-LT基因的两种重组慢病毒,进一步共同感染原代LT细胞,经嘌呤霉素加压筛选,将hTERT和SV40-LT基因整合到原代LT细胞的染色体中,筛选并获得稳定传代的LT细胞。提取上述细胞的DNA和RNA,利用荧光PCR与IFA分别在基因水平与蛋白水平检测hTERT与SV40-LT的表达,鉴定为阳性的亚克隆即为永生化羔羊睾丸细胞(immortalized lamb testis,ILT)。检测ILT的细胞生长曲线、细胞存活率,传代稳定性等特性,进一步检测ILT细胞对GTPV的生长特性并与其在Vero细胞的生长特性进行比较。结果表明,本研究利用慢病毒载体将hTERT和SV40-LT基因成功转入原代LT细胞中,成功建立了稳定表达SV40-LT基因与hTERT基因的ILT细胞;传代试验表明ILT细胞至少可以稳定传40代;ILT细胞与原代LT细胞形态一致,细胞的生长速度比原代LT细胞速度快;GTPV能够很好地在ILT细胞中繁殖,在病毒感染后第5天,TCID_(50)达到10^(5.4) TCID_(50)/mL,比在Vero细胞中的生长速度快。该研究成功为GTPV的疫苗生产及后续病毒的分子生物学研究提供了重要的试验材料。 展开更多

关键词 sv40-lt hTERT 羔羊睾丸细胞 山羊痘病毒 永生化细胞

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