十字花科作物主要由S位点的复等位基因控制自交不亲和性,羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)是十字花科芸薹属中典型的自交不亲和性植物。本研究利用20对SSR引物首次构建了20个羽衣甘蓝自交系的指纹图谱,20对SSR引物共鉴定到65...十字花科作物主要由S位点的复等位基因控制自交不亲和性,羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)是十字花科芸薹属中典型的自交不亲和性植物。本研究利用20对SSR引物首次构建了20个羽衣甘蓝自交系的指纹图谱,20对SSR引物共鉴定到65个等位变异,平均每对引物含有3.25个变异。等权重算术平均聚类法(UPGMA)将20个自交系聚类为3个遗传类群:OK1、OK2和OK3。其中遗传类群OK1的叶形为紧凑皱叶或披散皱叶,波浪状叶缘,叶色以红紫色为主;遗传类群OK2的叶形为光滑叶,波浪状或裂叶叶缘,叶色为白色外叶;遗传类群OK3的叶形为光滑叶,波浪状或裂叶叶缘,叶色以红紫色为主。利用SRK基因激酶区的特异性引物分析发现,20个羽衣甘蓝自交系中共有9个SRK单元型,分别是8个ClassⅠ型SRK单元型(SRK7、SRK13、SRK14、SRK16、SRK23、SRK36、SRK45和SRK51)和1个ClassⅡ型SRK单元型(SRK15)。遗传类群OK1主要为SRK15单元型(50%),其次为SRK23单元型(20%);遗传类群OK2主要为SRK15、SRK16单元型(均为40%);遗传类群OK3主要为SRK23单元型(40%)。亲和指数测定结果进一步验证了不同遗传类群内部或遗传类群间自交系杂交的亲和关系,杂交组合配制的过程中应兼顾遗传类群和SRK单元型。展开更多
【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息...【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、ARC1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至p GADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1—ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体p GBKT7(BD)质粒。用PEG/Li Ac法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着ARC1或Exo70A1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfam Exo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。展开更多
文摘十字花科作物主要由S位点的复等位基因控制自交不亲和性,羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)是十字花科芸薹属中典型的自交不亲和性植物。本研究利用20对SSR引物首次构建了20个羽衣甘蓝自交系的指纹图谱,20对SSR引物共鉴定到65个等位变异,平均每对引物含有3.25个变异。等权重算术平均聚类法(UPGMA)将20个自交系聚类为3个遗传类群:OK1、OK2和OK3。其中遗传类群OK1的叶形为紧凑皱叶或披散皱叶,波浪状叶缘,叶色以红紫色为主;遗传类群OK2的叶形为光滑叶,波浪状或裂叶叶缘,叶色为白色外叶;遗传类群OK3的叶形为光滑叶,波浪状或裂叶叶缘,叶色以红紫色为主。利用SRK基因激酶区的特异性引物分析发现,20个羽衣甘蓝自交系中共有9个SRK单元型,分别是8个ClassⅠ型SRK单元型(SRK7、SRK13、SRK14、SRK16、SRK23、SRK36、SRK45和SRK51)和1个ClassⅡ型SRK单元型(SRK15)。遗传类群OK1主要为SRK15单元型(50%),其次为SRK23单元型(20%);遗传类群OK2主要为SRK15、SRK16单元型(均为40%);遗传类群OK3主要为SRK23单元型(40%)。亲和指数测定结果进一步验证了不同遗传类群内部或遗传类群间自交系杂交的亲和关系,杂交组合配制的过程中应兼顾遗传类群和SRK单元型。
文摘【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、ARC1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至p GADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1—ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体p GBKT7(BD)质粒。用PEG/Li Ac法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着ARC1或Exo70A1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfam Exo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。
