RNA干扰作为植物抗病毒免疫的核心机制,其调控网络中SGS3(suppressor of gene silencing)基因在RDR6介导的双链RNA合成过程中扮演关键角色。为深入探究SGS3基因功能,对本氏烟草SGS3基因引入新型多靶点基因沉默系统——PTA(poly-tRNA-ami...RNA干扰作为植物抗病毒免疫的核心机制,其调控网络中SGS3(suppressor of gene silencing)基因在RDR6介导的双链RNA合成过程中扮演关键角色。为深入探究SGS3基因功能,对本氏烟草SGS3基因引入新型多靶点基因沉默系统——PTA(poly-tRNA-amiRNA)技术,并与传统单个amiRNA进行RNAi效率的系统性比较。首先针对SGS3基因的锌指(ZF)、XS和卷曲螺旋(coiled coil,CC)等三个结构域各设计合成一个特异性amiRNA,通过分子克隆技术构建pBI121-SGS3-amiRNA1/2/3重组表达载体。利用农杆菌介导的瞬时表达系统,对三个重组载体进行功能验证,结果显示amiRNA2对SGS3基因的沉默效率显著高于其他两个靶点。基于此,采用Golden Gate克隆技术,将上述三个amiRNA与三个tRNA串联组装,成功构建PTA-SGS3表达盒,并整合至pBI121植物表达载体。通过与携带绿色荧光蛋白标记的大豆花叶病毒侵染性克隆SMV-GFP共侵染本氏烟草,系统检测PTA系统的RNAi效率及抗病毒活性。RTqPCR分析表明,相较于单一amiRNA,PTA系统可使SGS3基因沉默效率提升44.8%,显著增强靶基因沉默效果。通过GFP荧光强度定量分析及DAB组织化学染色实验,发现经PTA表达盒侵染的本氏烟草中,SMV病毒积累量较单amiRNA处理组增加50.6%。展开更多
