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应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列
1
作者 朱金丽 何闪 +2 位作者 周秘 修乐山 邢朝斌 《河北联合大学学报（医学版）》 2012年第5期609-611,共3页
①目的克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列。②方法根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3&#... ①目的克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列。②方法根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列。③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段。④结论首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 刺五加内生青霉 鲨烯合酶基因 染色体步移 sefa-pcr
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盐单胞菌属BYS-1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达 被引量：10
2
作者 何健 黄星 +2 位作者 顾立锋 蒋建东 李顺鹏 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期28-32,共5页
利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,... 利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,预测编码的DAT(L-二氨基丁酸转氨酶)、DAA(L-二氨基丁酸乙酰转移酶)和ES(四氢嘧啶合酶)大小分别为21.1kDa(191 amino acid)、45.7kDa(417 amino acid)和14.5kDa(129 amino acid);将包含ectABC基因及其上游1000bp序列的片段克隆到pUC19中并转化E.coliDH5α,转化子E.coli(pUC19ECT)能够在盐激条件下合成四氢嘧啶,但其耐盐能力没有得到显著改善。 展开更多
关键词 四氢嘧啶 ectABC基因 sefa-pcr HALOMONAS sp.BYS-1 盐激表达
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Bacillus amyloliquefaciens C1菌株γ-PGA合成基因pgsBCAE的克隆与表达 被引量：1
3
作者 王世锋 何剑 +3 位作者 陈怡露 郑涛 沈其荣 雍晓雨 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期158-166,共9页
γ-PGA是微生物合成的一种新型高分子生物可降解材料,基因工程菌株的构建对于其合成机理及开发生产具有较高的研究价值。利用Self-Formed Adaptor PCR(SEFA-PCR)方法扩增出菌株B.amyloliqueficiens C1的γ-PGA合成酶基因簇pgs BCAE,将... γ-PGA是微生物合成的一种新型高分子生物可降解材料,基因工程菌株的构建对于其合成机理及开发生产具有较高的研究价值。利用Self-Formed Adaptor PCR(SEFA-PCR)方法扩增出菌株B.amyloliqueficiens C1的γ-PGA合成酶基因簇pgs BCAE,将其克隆到表达载体p ET29a(+)中并转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)。结果表明,转化所得的工程菌株在IPTG诱导下通过摇瓶发酵生产0.14 g/L的γ-PGA。Mn2+和Zn2+能够显著促进重组子E.coli BL21(p ET29α-pgs BCAE)发酵合成γ-PGA的产量,并且这种促进作用随着Mn2+和Zn2+浓度的提高而越加显著。Mg2+在低浓度(1 mmol/L)下也促进重组子合成γ-PGA,之后随着Mg2+浓度的升高,这种促进作用逐渐减弱,当Mg2+浓度达到4 mmol/L时,反而抑制重组子γ-PGA的合成。菌株B.amyloliqueficiens C1基因组内含有完整的γ-PGA合成酶基因簇pgs BCAE,该基因簇能够在表达宿主E.coli BL21中被诱导表达并合成γ-PGA,且其γ-PGA的合成受金属离子的影响。 展开更多
关键词 γ-多聚谷氨酸 合成基因 sefa-pcr 异源表达 金属离子
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假单胞菌DLL-E4尿黑酸降解基因的克隆与功能的初步分析 被引量：1
4
作者 沈文静 邓海华 +4 位作者 曹慧 李晓丹 王世明 崔中利 李顺鹏 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第S1期445-450,共6页
通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, Phe)为唯一碳源生长。SEFA-PCR扩增转座子侧... 通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, Phe)为唯一碳源生长。SEFA-PCR扩增转座子侧翼序列发现其与已报道的尿黑酸1,2-双加氧酶基因hmgA的同源性为92%。将hmgA定向克隆至表达载体pET-29a中,转化至Escherichia coli BL21,经IPTG诱导后可表达分子量约为48kD的蛋白;诱导后转化子粗酶液对尿黑酸有很好的降解效果。将hmgA连入自杀性载体pEX19Gm,通过同源重组整合至M18染色体中,使其恢复了DLL-E4利用Phe的能力,证实了HmgA是尿黑酸苯环裂解酶。 展开更多
关键词 尿黑酸1 2-双加氧酶 转座子标签法 sefa-pcr 同源重组 基因敲入
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农药污染微生物降解研究及应用进展 被引量：26
5
作者 崔中利 崔利霞 +3 位作者 黄彦 闫新 何健 李顺鹏 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期93-102,共10页
农药污染与人们的日常生活息息相关,一直是科学家关注的环境污染热点问题。微生物因其种类丰富、分布广泛、适应性强和代谢途径多样的特点显现出自身在农药污染治理方面的优势。本文总结了近10年来,南京农业大学农业部农业环境微生物重... 农药污染与人们的日常生活息息相关,一直是科学家关注的环境污染热点问题。微生物因其种类丰富、分布广泛、适应性强和代谢途径多样的特点显现出自身在农药污染治理方面的优势。本文总结了近10年来,南京农业大学农业部农业环境微生物重点开放实验室在农药残留微生物降解方面取得的进展,从降解性微生物资源的分离收集,到微生物降解代谢途径分析、降解过程中的关键基因或基因簇的克隆,及在微生物遗传操作方法 SEFA PCR(self-formed adaptor PCR)、基因工程菌的构建等方面进行了详细论述,旨在为降解性微生物在环境修复、生物转化等方面的应用提供理论和实践依据。 展开更多
关键词 农药污染 微生物资源 代谢途径 基因或基因簇 SEFA PCR 基因工程菌
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Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达 被引量：9
6
作者 管莉菠 蔡天明 +3 位作者 李波 何健 李顺鹏 崔中利 《土壤学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期727-733,共7页
以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约... 以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约528 bp)。随后采用快速染色体步移方法(Self-formed adap-tor PCR,SEFA-PCR)技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp(GenBank accession number DQ133537)。构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物。且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%(对照菌株的磷去除率仅为18%),远高于已报道的40%的去除率。这表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐。 展开更多
关键词 多聚磷酸盐激酶 ppk全基因及上下游序列 快速染色体步移方法(SEFA—PCR)
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灵芝漆酶基因转录Cu^(2+)诱导特性及其启动子的克隆与序列分析 被引量：5
7
作者 欧阳翔 吴婧 +2 位作者 丁一新 李玉祥 赵明文 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期36-40,共5页
以Cu2+为诱导物检测了灵芝漆酶同工酶基因的转录特性,并对其启动子进行了克隆及序列分析。研究发现:灵芝漆酶基因在Cu2+的作用下表达量出现明显差异,其中以在发酵液中添加3.0 mmol.L-1Cu2+、诱导时间为6 d时,漆酶基因的mRNA表达量最高... 以Cu2+为诱导物检测了灵芝漆酶同工酶基因的转录特性,并对其启动子进行了克隆及序列分析。研究发现:灵芝漆酶基因在Cu2+的作用下表达量出现明显差异,其中以在发酵液中添加3.0 mmol.L-1Cu2+、诱导时间为6 d时,漆酶基因的mRNA表达量最高。根据GenBank中已报道的灵芝漆酶基因的序列信息,经PCR扩增获得了灵芝漆酶5′端长879bp的基因特异序列,进而通过self-formed adaptor PCR(SEFA-PCR)方法,扩增得到灵芝漆酶基因起始密码子上游长832bp的启动子序列。分析表明,该启动子区域除分布有TATA-box、CAAT-box及GC-box等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括4个MRE元件、4个STRE元件、11个HSE元件和5个氮因子结合位点等。 展开更多
关键词 灵芝 漆酶 半定量RT—PCR self-formed ADAPTOR PCR 转录调控
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枇杷醇腈酶基因的克隆及结构分析 被引量：1
8
作者 赵冠杰 白锴凯 +1 位作者 郑允权 郭养浩 《福州大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期960-964,共5页
根据已知的杏仁、黑樱桃醇腈酶基因序列设计了一对同源引物,扩增得到枇杷醇腈酶基因的部分序列.分别设计了三条基因特异性引物和一条基因非特异性引物,采用改进的SEFA PCR方法,进行上下游未知序列的扩增,成功地获得包括启动子区、转录... 根据已知的杏仁、黑樱桃醇腈酶基因序列设计了一对同源引物,扩增得到枇杷醇腈酶基因的部分序列.分别设计了三条基因特异性引物和一条基因非特异性引物,采用改进的SEFA PCR方法,进行上下游未知序列的扩增,成功地获得包括启动子区、转录终止子在内的枇杷醇腈酶基因序列,全长5.5 kbp.所得醇腈酶基因含有4个外显子和3个内含子.编码的氨基酸残基序列包括25个氨基酸残基的信号肽和527个氨基酸残基的成熟酶蛋白.采用重叠延伸PCR方法将4个外显子连接获得了连续的醇腈酶编码基因,与pET27b(+)质粒成功构建表达载体,转化Rosetta(DE3).表达的醇腈酶大部分以包涵体形式存在,最终表达的酶活力为1.2 U.mL-1. 展开更多
关键词 醇腈酶 枇杷 SEFAPCR TailPCR 基因克隆
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