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用SDSL-EPR技术测量LSECtin-CRD与甘露糖结合过程中的位点运动性变化
1
作者 马蕾 董国福 +6 位作者 丛建波 杨俊涛 邹洁芮 郭俊旺 张成岗 王长振 吴可 《生物技术通讯》 CAS 2016年第3期381-385,共5页
目的:应用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)的糖基识别结构域CRD上不同位点氨基酸的运动特性及其与甘露糖结合过程中的构象变化。方法:通过SOE-PCR方法对LSECtin-CRD引入半胱氨酸... 目的:应用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)的糖基识别结构域CRD上不同位点氨基酸的运动特性及其与甘露糖结合过程中的构象变化。方法:通过SOE-PCR方法对LSECtin-CRD引入半胱氨酸点突变,构建p ET28b-Tat-LSECtin-CRD载体,可溶性表达LSECtin-CRD突变体蛋白;对突变位点进行自旋标记;EPR检测标记后样品的EPR波谱;用SS-FDDM软件对EPR波谱进行模拟和解析,获得旋转相关时间τc,研究其构象特点及变化。结果:在CRD的Ca^(2+)结合位点和配体结合功能区构建了5个突变体蛋白;LSECtin-CRD与Ca^(2+)和甘露糖结合后,4个位点的τc值明显升高,表明CRD结构域整体运动性降低;5个突变位点运动性差异较大,其中A258位点运动性变化最大,可能是参与糖基结合的关键位点。结论:SDSL-EPR技术能够有效研究LSECtin-CRD参与糖基结合过程中的构象运动性,研究结果证明了LSECtin-CRD在与糖基结合后整体运动性受限。 展开更多
关键词 定点自旋标记-电子顺磁共振技术(sdsl-epr) 肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin) 糖基识别结构域(CRD) 运动性
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SDSL-EPR技术检测LC3B蛋白功能结构域中特定位点的运动特性 被引量：3
2
作者 赵曦 董国福 +2 位作者 马蕾 郭俊旺 吴可 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第9期664-668,共5页
目的用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测自噬相关蛋白LC3B功能结构域上特定氨基酸位点的运动特性。方法采用序列重叠延伸PCR(SOE-PCR)法对LC3B蛋白NHD结构域α1螺旋Q9位点、ULD结构域α3螺旋N59位点以及口袋结构内部β1折叠... 目的用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测自噬相关蛋白LC3B功能结构域上特定氨基酸位点的运动特性。方法采用序列重叠延伸PCR(SOE-PCR)法对LC3B蛋白NHD结构域α1螺旋Q9位点、ULD结构域α3螺旋N59位点以及口袋结构内部β1折叠135位点引入半胱氨酸(cysteamine,Cys)突变,表达纯化获得LC3B突变体蛋白;甲烷硫代磺酸(2,2,5,5-tetramethyl-1-oxyl-3-methyl methanethiosulfonate,MTSL)自旋标记后进行电子顺磁共振(EPR)检测,通过计算EPR波谱旋转相关时间τc,分析不同氨基酸位点的运动特性。结果构建了LC3B突变体基因的原核表达载体pET-22b-LC3B,实现了蛋白的可溶性高效表达;Q9C和N59C位点EPR波谱呈现双成分叠加谱,Q9C位点不同运动成分的τc值分别为1和3.8 ns,N59C位点为1和3.4 ns;I35C位点为三成分叠加谱,其τc值分别为0.7、2.9和8.1 ns。结论存在于特定氨基酸位点的运动性差别,预示着溶液状态下LC3B蛋白各功能结构域的同一氨基酸位点处可能存在不同的构象特征。 展开更多
关键词 sdsl-epr 自噬相关蛋白质类 LC3B 旋转相关时间 运动性
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电子顺磁共振测量蛋白质分子内选定位点之间距离的方法及应用 被引量：1
3
作者 吴可 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期285-293,共9页
蛋白质分子的结构决定了其特性和功能,准确测量蛋白质分子中特殊位点之间的距离对其结构解析至关重要。该文在简要介绍电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)方法测量蛋白质分子内未偶自旋之间距离基本原理的基础上,重点... 蛋白质分子的结构决定了其特性和功能,准确测量蛋白质分子中特殊位点之间的距离对其结构解析至关重要。该文在简要介绍电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)方法测量蛋白质分子内未偶自旋之间距离基本原理的基础上,重点综述了近年来EPR结合定点自旋标记(site-directed spin label,SDSL)技术在研究蛋白质结构与功能方面的应用情况,归纳了EPR-SDSL方法测量距离的特点和存在问题,并提出了改进用连续波EPR技术测量距离的准确度的思路和实现方法。 展开更多
关键词 电子顺磁共振 定点自旋标记 距离测量 蛋白质结构
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细菌外膜蛋白BamA突变体构建及位点运动性分析
4
作者 王媛 李志慧 +3 位作者 魏倩 董国福 储引娣 王长振 《军事医学》 CAS 2022年第9期677-681,共5页
目的构建细菌外膜β桶状蛋白组装机器(BAM)核心组分BamA点突变原核表达载体,获得特定位点突变BamA蛋白,并分析该蛋白多肽易位相关(POTRA)结构域上G313位点运动特性。方法利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将BamA蛋白第690和700位天然半胱氨酸(C... 目的构建细菌外膜β桶状蛋白组装机器(BAM)核心组分BamA点突变原核表达载体,获得特定位点突变BamA蛋白,并分析该蛋白多肽易位相关(POTRA)结构域上G313位点运动特性。方法利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将BamA蛋白第690和700位天然半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S),将POTRA结构域上第313位氨基酸由甘氨酸(G)突为C,构建含BamA-C690S-C700S-G313C突变的原核表达载体pET22b-Strep-BamA。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导突变蛋白表达后,利用Strep-Tactin Sepharose柱亲和层析方法对突变体蛋白进行纯化。甲烷硫代磺酸(MTSL)标记所得纯化蛋白的半胱氨酸后,进行电子顺磁共振(EPR)波谱检测,通过EPR波谱拟合获得旋转相关时间τ_(c),分析G313C氨基酸位点的运动特性。结果构建了BamA-C690S-C700S-G313C突变体原核表达载体,实现了突变体蛋白有效表达和纯化。G313C位点EPR波谱为单成分运动状态波谱,其τc值为(2.30±0.03)ns。结论该研究建立了BamA点突变原核表达和蛋白纯化方法,并获得BamA蛋白G313C运动性特征参数,为进一步研究BamA蛋白在外膜蛋白整合过程中的结构机制提供了数据。 展开更多
关键词 细菌外膜蛋白质类 BamA 突变 定点自旋标记-电子顺磁共振 运动性
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