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PEDV S1-NTD和S1-CTD不同组合假病毒的构建及鉴定
1
作者 张永晨 齐珊珊 +3 位作者 李春秋 朱庆贺 邢晓旭 孙东波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期46-52,共7页
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种具有高度传染性的冠状病毒,可引起仔猪严重腹泻和高死亡率。PEDV刺突糖蛋白(spike,S)中S1亚基N末端结构域(S1 subunit N-terminal domain,S1-NTD)和C末端结构域(S1subunit... 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种具有高度传染性的冠状病毒,可引起仔猪严重腹泻和高死亡率。PEDV刺突糖蛋白(spike,S)中S1亚基N末端结构域(S1 subunit N-terminal domain,S1-NTD)和C末端结构域(S1subunit C-tjerminal domain,S1-CTD)在病毒入侵过程中发挥重要作用,但其机制尚未完全阐明。为进一步探索PEDV S1-NTD和S1-CTD在病毒入侵宿主细胞过程中的协同作用,研究利用水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)假病毒系统,构建了PEDV经典毒株CV777和PEDV GIIa型变异毒株HM2017的S1-NTD和S1-CTD不同组合S蛋白假病毒,分别命名为rvCV777-S1-NTD+CV777-S1-CTD、rvCV777-S1-NTD+HM2017-S1-CTD、rvHM2017-S1-NTD+CV777-S1-CTD和rvHM2017-S1-NTD+HM2017-S1-CTD,并对构建的重组病毒进行鉴定。结果显示:透射电镜(TEM)观察到不同组合的S蛋白假病毒均呈直径约180 mn的典型子弹状粒子;Western blot检测显示,表达不同的S1-NTD和S1-CTD组合S蛋白的假病毒与PEDV S蛋白单克隆抗体均发生特异性反应,条带大小为180 kDa;间接免疫荧光试验表明,实验组均呈现清晰的绿色荧光。上述结果证明,研究成功构建了不同S1-NTD和S1-CTD组合的S蛋白假病毒,为PEDV入侵机制研究提供了实验基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 水疱性口炎病毒 s1-NTD s1-ctd 假病毒
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猪丁型冠状病毒S1-CTD相互作用宿主蛋白的筛选和鉴定 被引量：4
2
作者 汤荣锋 范前进 +5 位作者 郭龙军 张鑫 石达 时洪艳 陈建飞 冯力 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2260-2267,共8页
猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的... 猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的蛋白并进行质谱分析,发现32个疑似相互作用的宿主蛋白。构建其中可能与S1-CTD互作的蛋白KIF1 binding protein(KIFBP)的真核表达质粒,通过免疫共沉淀和激光共聚焦验证上述宿主蛋白与S1-CTD是否存在相互作用,结果表明KIFBP和S1-CTD之间存在相互作用,共同转染时在细胞质共定位。进一步研究表明,过表达KIFBP能够有效降低病毒RNA水平和病毒滴度,其中mRNA水平降低了约70%,病毒滴度降低了10^(1.6)TCID_(50)。综上,本研究筛选并鉴定出一种与PDCoV S1-CTD相互作用的宿主蛋白KIFBP,为了解PDCoV的致病机制提供了理论基础。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 s1-ctd蛋白 相互作用 KIFBP
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猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立 被引量：3
3
作者 瞿欢 李成 +5 位作者 陈汭 廖艺杰 曹三杰 文翼平 颜其贵 黄小波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期273-280,共8页
猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区... 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区(位于S基因的832-1 848 bp),构建原核表达载体pET28a-S1-CTD,表达的重组S1-CTD蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约41 kD,Western Blot证明其有良好的反应原性。以重组S1-CTD 蛋白为抗原建立间接ELISA,抗原最佳包被浓度为1μg/孔,待检血清的最佳稀释度为1∶50,阴阳性临界值为OD_(450nm)≥0.377。该ELISA检测其他8种常见猪病阳性血清无交叉反应,特异性好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性好。ELISA与病毒中和试验的总符合率达83.3%。用建立的ELISA检测了2012-2017年四川部分猪场490份临床血清,结果显示血清中PDCoV抗体阳性率为49.18%。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 s1-ctd蛋白 原核表达 间接ELIsA
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猪流行性腹泻病毒S1蛋白的原核表达及其核酸适配体的筛选
4
作者 张冬萱 王智豪 +3 位作者 乔岩 赵肖肖 范松杰 张超 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期839-850,共12页
本文旨在可溶性原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白的C端结合域(S1-CTD),并利用指数富集的配体系统进化技术筛选靶向S1-CTD蛋白的DNA适配体,为该病毒治疗药物的开发以及检测方法的建立奠定基础。采... 本文旨在可溶性原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白的C端结合域(S1-CTD),并利用指数富集的配体系统进化技术筛选靶向S1-CTD蛋白的DNA适配体,为该病毒治疗药物的开发以及检测方法的建立奠定基础。采用大肠杆菌原核表达系统,将PEDV-S1-CTD质粒与带有麦芽糖结合蛋白(MBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、反转录终止因子(NusA)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)四种促溶标签的原核表达载体pET21b连接,构建重组质粒pET21b-MBP-S1、pET21b-SUMO-S1、pET21b-NusA-S1、pET21b-GST-S1,将双酶切鉴定和测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,选择可溶性好且表达量高的rMBP-S1重组蛋白进行后续试验,Western blot结果显示该重组蛋白正确表达,间接免疫荧光试验(IFA)结果表明rMBP-S1能与细胞表面受体结合。随后经磁珠法筛选得到111条靶向rMBP-S1重组蛋白的候选DNA适配体,其中Apt-S1-3、Apt-S1-11富集程度最高,分别是18%和16.2%,酶联适配体吸附试验ELASA(enzyme-linked aptamer sorbent assays,ELASA)测定适配体Apt-S1-3的解离常数为2.09 nmol,并且该适配体不与rMBP蛋白、rMBP-gD蛋白、rMBP-GP5蛋白以及BSA蛋白发生交叉反应,表明该适配体具有高亲和力与高特异性。此外,使用在线软件Mfold分析适配体Apt-S1-3形成的二级结构,并且通过分子对接模拟,发现该适配体能够与靶标蛋白形成稳定的复合物。最后的间接免疫荧光试验表明适配体Apt-S1-3能够识别PEDV,流式细胞术试验证实该适配体能够抑制PEDV感染宿主细胞。本研究筛选得到的DNA适配体能够与猪流行性腹泻病毒S1-CTD蛋白高亲和力、高特异性结合,而且能够抑制猪流行性腹泻病毒感染细胞,为PEDV的靶向治疗和检测方法开发奠定基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 s1-ctd蛋白 磁珠法 核酸适配体 亲和力
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猪δ冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
5
作者 尚再卓 于瑞明 +5 位作者 张莉萍 王永录 潘丽 杜晓华 刘霞 刘新生 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期2339-2346,共8页
以大肠杆菌表达系统表达的猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)截短抗原S1-CTD蛋白作为包被抗原,建立能够检测血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法。以本实验室分离保存的PDCoV流行株CH/XJYN/2016(MN064712)的S基因为模板设计... 以大肠杆菌表达系统表达的猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)截短抗原S1-CTD蛋白作为包被抗原,建立能够检测血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法。以本实验室分离保存的PDCoV流行株CH/XJYN/2016(MN064712)的S基因为模板设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增出S基因抗原表位区S1-CTD(877~1299 bp),构建原核表达载体pET24a-S1-CTD,经IPTG诱导表达重组蛋白S1-CTD,纯化后作为包被抗原建立了检测PDCoV特异性IgA抗体的间接ELISA方法。结果显示,抗原最佳包被质量浓度为8 mg/L,血清和酶标二抗最佳稀释比例为1∶10和1∶5000;S/P≥0.489判定为阳性,S/P<0.489判定为阴性。该方法与猪流行性腹泻病毒、猪嵴病病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒的标准阳性血清均无交叉反应,特异性良好;批内和批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性。间接ELISA检查方法的建立为PDCoV的血清学调查及免疫效果评价提供了有效的检测手段,为进一步开发临床检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 s1-ctd蛋白 间接ELIsA IGA抗体
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