传染性支气管炎病毒S1蛋白中和表位-Fc融合蛋白的表达及免疫原性鉴定

1

作者 郭森 李慧昕 +2 位作者 韩宗玺 孙军峰 夏长友 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第11期5758-5769,共12页

为构建禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白的免疫原,本研究通过比对已公布的S1中和表位和当前我国流行的GI-19型代表毒株ck/CH/LDL/091022(LDL091022)S1蛋白氨基酸序列,鉴定第22—100和410—492位氨基酸区域为中和表位优势区,分别命名为B1... 为构建禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白的免疫原,本研究通过比对已公布的S1中和表位和当前我国流行的GI-19型代表毒株ck/CH/LDL/091022(LDL091022)S1蛋白氨基酸序列,鉴定第22—100和410—492位氨基酸区域为中和表位优势区,分别命名为B1和B2。构建表达LDL091022 B1和B2的质粒以及在C端融合鸡IgY Fc片段的质粒,通过Western blot和IFA检测发现融合IgY Fc片段后能够显著提高蛋白的表达量。转染Expi 293F细胞表达并纯化获得了融合IgY Fc片段的重组蛋白B1-Fc和B2-Fc。通过Western blot和ELISA鉴定B1-Fc和B2-Fc与LDL091022血清的反应性,结果发现B2-Fc与血清的反应性明显优于B1-Fc。将质粒pCAGGS-B2-Fc和重组蛋白B2-Fc免疫SPF鸡,通过ELISA和IFA检测血清中的抗体水平,结果显示B2-Fc加强免疫后能够有效诱导针对B2表位的抗体,且IFA结果显示血清能与LDL091022-S1蛋白和B2-Fc发生特异性反应。进一步利用中和试验检测血清中和效价为16。上述结果表明,本研究制备的IBV S1蛋白中和表位-Fc融合蛋白具有良好的表达水平和免疫原性,能够诱导机体产生一定水平的中和抗体,为进一步研发新型IBV亚单位疫苗提供了借鉴。 展开更多

关键词 禽传染性支气管炎病毒 s1亚基 中和表位 IgY Fc片段 免疫原性

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百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化 被引量：1

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作者 张晓丽 邹全明 +1 位作者 章金勇 张卫军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第4期264-266,270,共4页

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得... 目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。 展开更多

关键词 百日咳毒素 s1亚单位 突变体 原核表达

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分子修饰的重组百日咳毒素S1亚单位的生物学和免疫学特性 被引量：4

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作者 于康震 Burnette W N +1 位作者 Kaslow H R Yilma T D 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期151-154,共4页

目的：对重组杆状病毒表达的经多种信号序列修饰的天然和变异百日咳毒素（ＰＴ）Ｓ１亚单位（ｒＳ１）的生物学及免疫学特性作出评价。方法：应用生物化学和免疫学技术与方法对这些ｒＳ１的酶活性、分泌性和免疫原性等做了系统鉴定。结... 目的：对重组杆状病毒表达的经多种信号序列修饰的天然和变异百日咳毒素（ＰＴ）Ｓ１亚单位（ｒＳ１）的生物学及免疫学特性作出评价。方法：应用生物化学和免疫学技术与方法对这些ｒＳ１的酶活性、分泌性和免疫原性等做了系统鉴定。结果：ｒＳ１变异子无可检出的酶活性；所有ｒＳ１均不能由细胞分泌，可从细胞膜组分中大量检出，但不能从可溶性胞浆蛋白组分或细胞培养上清中检出；ｒＳ１分子内部含有３个疏水性区域；ｒＳ１虽不能与Ｂ寡聚体结合形成ＰＴ全毒素，但均能诱导抗ＰＴ免疫应答。结论：这些ｒＳ１极可能以膜蛋白形式存在，其非分泌性与分子内部的疏水性区域有关；所有ｒＳ１均保持其免疫原性。 展开更多

关键词 百日咳毒素 s1亚单位 生物学特性 免疫应答

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百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达 被引量：4

4

作者 于康震 Burnette WN +3 位作者 Kaslow HR Mar VL Ahmad S Yilma TD 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期52-55,共4页

目的：百日咳毒素既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是重要的保护性抗原，其Ｓ１亚单位具有ＡＤＰ核糖转移酶活性和免疫保护性决定簇。为高效表达前构建的一个丧失酶活性但仍保持保护决定簇的Ｓ１变异子，开展了本研究。方法：通过添加... 目的：百日咳毒素既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是重要的保护性抗原，其Ｓ１亚单位具有ＡＤＰ核糖转移酶活性和免疫保护性决定簇。为高效表达前构建的一个丧失酶活性但仍保持保护决定簇的Ｓ１变异子，开展了本研究。方法：通过添加人流感病毒血凝素基因信号序列或嵌膜序列的方法，对天然和变异Ｓ１亚单位基因片段作了遗传学修饰。然后使用重组杆状病毒技术使这些Ｓ１亚单位在昆虫细胞和昆虫幼虫中实现了高水平表达。结果：这些重组Ｓ１的表达水平介于每万个昆虫卵细胞０１８～１９３μｇ或每只昆虫幼虫０４６～４９８ｍｇ之间。天然信号肽和ＨＡ信号肽均可完整表达，但后者的切割效率（６１％～８１％）比前者（１６％～１９％）更高。所有带信号肽的Ｓ１亚单位均呈异质性表达（双带）。结论：重组Ｓ１亚单位的表达是高效和正确的，表达的异质性是由于信号肽切割不完全的缘故。 展开更多

关键词 百日咳毒素 s1亚单位 重组杆状病毒 分子修饰

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重组百日咳毒素S1亚单位的纯化及免疫原性 被引量：2

5

作者 杨晓明 乔瑞洁 《微生物学免疫学进展》 2003年第4期24-27,共4页

将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOP10两株大肠杆菌中进行表达 ,并对表达产物进行了初步纯化。粗制的rS1免疫家兔所得血清 ,用HP—PT及 1B7—PT包被的ELISA测定效价 ,并做被动免疫保护试验。抗PT的抗体滴度为 1∶32 0 0 0... 将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOP10两株大肠杆菌中进行表达 ,并对表达产物进行了初步纯化。粗制的rS1免疫家兔所得血清 ,用HP—PT及 1B7—PT包被的ELISA测定效价 ,并做被动免疫保护试验。抗PT的抗体滴度为 1∶32 0 0 0。该抗rSl血清在小鼠被动免疫保护试验中 ,对百日咳杆菌 1832 3毒株进行脑腔攻击的被动免疫保护作用达到 10 0 %。证明rS1亚单位具有良好的抗原性和免疫原性 ,并与天然S1具有相同的抗原表位。 展开更多

关键词 百日咳杆菌 百日咳毒素s1亚单位 免疫保护 纯化 基因重组 大肠杆菌

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百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

6

作者 时成波 曹玉锋 +4 位作者 张秀霞 吴晓娟 李雨桐 徐光磊 尹晓东 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第4期320-322,共3页

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序... 目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 百日咳毒素 s1亚基 原核表达 重叠PCR

原文传递

百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法的建立及应用

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作者 马强 林冠峰 +2 位作者 邹丽萍 李明 吴英松 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1509-1512,共4页

目的建立铕(Eu3+)标记检测百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法。方法利用原核重组表达系统表达百日咳毒素S1亚基蛋白,并鉴定,采用双抗体夹心法建立检测S1 TRFIA分析方法。结果自制S1试剂盒检测灵敏度2.5 ng/ml,与其他抗原无交... 目的建立铕(Eu3+)标记检测百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法。方法利用原核重组表达系统表达百日咳毒素S1亚基蛋白,并鉴定,采用双抗体夹心法建立检测S1 TRFIA分析方法。结果自制S1试剂盒检测灵敏度2.5 ng/ml,与其他抗原无交叉反应,并初步可应用于百日咳疫苗中免疫原的监测。结论自制百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法能够较为可靠的监控百日咳疫苗质量。 展开更多

关键词 百日咳 s1亚基 时间分辨免疫荧光分析法

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百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达

8

作者 李庆雷 于康震 +1 位作者 马丽英 王孝铭 《中国免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2000年第1期12-14,共3页

目的：为探明校基端疏水区对百日咳毒素Ｓ１亚单位分泌性的影响，试图构建缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位。方法：应用ＰＣＲ技术构建了６种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位编码基因，并使用重组杆状病毒（ｒＢＶ）技术... 目的：为探明校基端疏水区对百日咳毒素Ｓ１亚单位分泌性的影响，试图构建缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位。方法：应用ＰＣＲ技术构建了６种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位编码基因，并使用重组杆状病毒（ｒＢＶ）技术实现了这些缺失Ｓ１亚单位（ｔＳ１）在昆虫细胞中的高水平表达。结果：这些缺失Ｓ１亚单位的表达量为每万个昆虫细胞１．０１～２．２５ｕｇ。细菌信号肽和流感病毒ＨＡ信号肽均能完整表达和正确剪切，但ＨＡ信号肽在昆虫细胞中的处理效率更高。结论：ｔＳ１亚单位缺失羧基端疏水区后在昆虫细胞中的表达量明显提高，这些ｔＳ１亚单位的异源性表达是由于信号肽剪切不全所导致，ｔＳ１分子表观分子量的漂移并不意味着信号肽剪切不正确。 展开更多

关键词 百日咳毒素 s1亚单位 重组杆状病毒 信号肽

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百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用 被引量：2

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作者 杨瑜 朱为 +3 位作者 应通峰 黄帼英 徐帆洪 瞿爱东 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第12期1058-1061,1069,共5页

目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-P... 目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。 展开更多

关键词 百日咳毒素 s1亚单位 截短片段 克隆 表达 纯化 ELISA

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基于特征肽段定量新冠病毒刺突蛋白S1亚基的方法建立 被引量：2

10

作者 马玉清 夏文强 +4 位作者 张雅芬 崔海峰 汤近天 俞晓平 叶子弘 《中国计量大学学报》 2021年第4期439-445,459,共8页

目的:建立基于特征肽段的新冠病毒刺突蛋白S1亚基定量方法。方法:根据蛋白序列、糖基化修饰位点等筛选特征肽段;利用胰蛋白酶水解蛋白为相对分子质量较小的肽段,并优化反应参数;最后结合同位素稀释质谱法建立刺突蛋白S1亚基定量检测方法... 目的:建立基于特征肽段的新冠病毒刺突蛋白S1亚基定量方法。方法:根据蛋白序列、糖基化修饰位点等筛选特征肽段;利用胰蛋白酶水解蛋白为相对分子质量较小的肽段,并优化反应参数;最后结合同位素稀释质谱法建立刺突蛋白S1亚基定量检测方法,并进行方法学考察。结果:基于特征肽段的同位素稀释质谱法检测样品中S1亚基质量分数为1.007×10^(-3),扩展不确定度为0.070×10^(-3),结果准确,与基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法检测结果比较无显著差异。特征肽段质量分数在0.47×10^(-9)~1×10^(-3)范围内,回归相关系数R^(2)>0.9999,线性良好。该方法日内与日间精密度均小于5%,检测准确度均在95%~105%之间,重复性良好。该方法不受基质中其他蛋白的干扰,可溯源至国际单位制,有助于该蛋白绝对定量、标准物质研制等。结论:该方法可行性良好,后期可供参考用于新冠病毒刺突蛋白S1亚基的定量。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 刺突蛋白s1亚基 特征肽段 定量方法 同位素稀释质谱法

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一起冠状病毒引起的牦牛犊牛腹泻的分子诊断 被引量：5

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作者 张琳 汤承 《青海畜牧兽医杂志》 2019年第6期6-10,共5页

2018年7月,青海省玉树地区一牦牛养殖户2~3月龄的犊牦牛爆发以腹泻为主要症状的疾病。本实验的目的是调查腹泻的病因并了解病原的分子特征。无菌采集9份犊牦牛腹泻粪便样本,采用PCR检测方法对牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒... 2018年7月,青海省玉树地区一牦牛养殖户2~3月龄的犊牦牛爆发以腹泻为主要症状的疾病。本实验的目的是调查腹泻的病因并了解病原的分子特征。无菌采集9份犊牦牛腹泻粪便样本,采用PCR检测方法对牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌、安氏隐孢子虫等6种常见致腹泻病原进行了检测。结果显示,9份样本中有6份为牛冠状病毒阳性,其它5种病原均未检出。对6份阳性样品进行冠状病毒S1亚基基因扩增,序列分析显示,6份样品中冠状病毒S1亚基有7个共同的氨基酸变异,区别于GenBank登录的冠状病毒该段氨基酸序列。系统发育显示6株冠状病毒的S1亚基基因有独特的遗传进化趋势。本实验结果为当地牦牛腹泻的防控提供了参考。 展开更多

关键词 犊牦牛 腹泻 PCR检测 牛冠状病毒 s1亚基

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冠状病毒S1亚基蛋白结构及其受体识别研究进展

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作者 姜逸 许海旭 +7 位作者 程旭 陈祥 高明燕 赵海娜 华姝 俞燕 龚建森 张笛 《江苏农业学报》 2025年第11期2267-2288,共22页

冠状病毒可感染哺乳动物和禽类,其高度遗传变异性显著影响其宿主范围与组织亲嗜性。近二十年来,3次由动物冠状病毒引发的人类疫情对全球公共卫生造成了严峻威胁。病毒刺突蛋白(S)是介导病毒入侵宿主细胞的关键,其S1亚基通过识别并结合... 冠状病毒可感染哺乳动物和禽类,其高度遗传变异性显著影响其宿主范围与组织亲嗜性。近二十年来,3次由动物冠状病毒引发的人类疫情对全球公共卫生造成了严峻威胁。病毒刺突蛋白(S)是介导病毒入侵宿主细胞的关键,其S1亚基通过识别并结合细胞表面受体,直接决定了病毒的宿主适应性与组织趋向性。近年来,随着冷冻电镜技术的发展,多种冠状病毒S蛋白的高分辨率三维结构得以解析。本综述基于冷冻电镜解析的冠状病毒S蛋白的高分辨率三维结构系统总结了不同动物与人类冠状病毒S1亚基的结构特征及其与多种细胞受体的互作机制,以期在为阐明冠状病毒跨种传播规律、预警潜在流行风险及开发广谱抗病毒药物提供依据。 展开更多

关键词 冠状病毒 刺突蛋白(S) s1亚基蛋白结构 受体

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