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结核分枝杆菌蛋白酶Rv1487对宿主免疫反应作用的研究
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作者 陈春文 姜艳艳 +10 位作者 郭若男 段祎凡 高云洁 张镇钧 冯婷婷 王慧 李梦雨 聂蝉蝉 崔莹莹 党光辉 刘思国 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第7期721-730,共10页
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种重要人兽共患传染病,现有的卡介苗无法对MTB感染提供有效的免疫保护。为探寻更有效的MTB保护性抗原,本团队前期通过生物信息学软件分析发现MTB Rv1487蛋白具有蛋白酶活性。为研究Rv1487蛋白酶对... 结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种重要人兽共患传染病,现有的卡介苗无法对MTB感染提供有效的免疫保护。为探寻更有效的MTB保护性抗原,本团队前期通过生物信息学软件分析发现MTB Rv1487蛋白具有蛋白酶活性。为研究Rv1487蛋白酶对宿主免疫反应的影响,本研究采用噬菌体介导的同源重组方法构建rv1487基因缺失株ΔRv1487和回补株ΔRv1487+Rv1487,并经PCR与southern blot鉴定正确后,将ΔRv1487与ΔRv1487+Rv1487株连续传5代,PCR鉴定结果显示,ΔRv1487+Rv1487株出现约345 bp的目的条带,ΔRv1487株则无该条带;Southern blot鉴定结果显示,经Bam H I酶切后H37Ra与ΔRv1487株分别出现4.3 kb与7.6 kb的目的条带,经Nhe I酶切后上述两株菌分别出现5.6 kb和8.9 kb的目的条带。传5代后回补株出现约435 bp的目的条带,缺失株则无该目的条带。表明正确构建了遗传稳定性较好的rv1487基因缺失株和回补株。通过检测各菌液OD_(600nm)值绘制生长曲线,利用H37Ra菌株感染小鼠和人巨噬细胞后不同时间通过qPCR检测细胞中rv1487基因的相对转录水平,将H37Ra、ΔRv1487和ΔRv1487+Rv1487株分别感染巨噬细胞12 h和24 h,通过qPCR检测促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)基因的相对转录水平;感染后12 h、24 h和48 h,分别采用qPCR检测细菌在巨噬细胞胞内的定植量。生长曲线测定结果显示,各菌株的生长速度基本一致;qPCR检测结果显示,与未感染H37Ra的巨噬细胞相比,感染后72 h该细胞中rv1487基因的转录水平显著升高(P<0.05),感染后不同时间人巨噬细胞中rv1487基因的转录水平均极显著升高(P<0.01和P<0.001);感染后12 h和24 h,ΔRv1487株感染的细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的转录水平均显著和极显著低于H37Ra和ΔRv1487+Rv1487株感染的细胞(P<0.05、P<0.01和P<0.001)。感染后24 h和48 h,ΔRv1487株感染细胞中的细菌数显著高于H37Ra菌株感染的细胞(P<0.05);感染后12 h和24 h,ΔRv1487株感染细胞中的细菌数显著和极显著高于ΔRv1487+Rv1487株感染的细胞(P<0.05、P<0.001)。以上结果表明,Rv1487蛋白酶参与MTB的感染过程,促进促炎细胞因子的转录并增强Th1及Th17细胞免疫应答,抑制MTB在巨噬细胞内的定植。本研究为MTB候选抗原蛋白的筛选及结核病疫苗的研究提供参考依据。 展开更多
关键词 rv1487 蛋白酶 结核分枝杆菌 巨噬细胞 免疫反应
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