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转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性 被引量：16
1
作者 路妍 张增艳 +8 位作者 任丽娟 刘宝业 廖勇 徐惠君 杜丽璞 马鸿翔 任正隆 井金学 辛志勇 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期640-646,共7页
Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot... Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T1至T4代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。 展开更多
关键词 抗菌肽 rs-afp2 转基因小麦 基因表达 纹枯病抗性
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基因枪法介导转人工合成Rs-AFP2基因小麦的获得和检测 被引量：7
2
作者 廖勇 张增艳 +4 位作者 徐惠君 杜丽璞 姚乌兰 辛志勇 任正隆 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期15-19,共5页
萝卜（Raphanus sativus）抗菌肽Rs—AFP2在体外强烈抑制小麦赤霉病菌（Fusarium graminenrum）、黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）、烟草赤星病（Alternaria longipes）的菌丝生长。为了研究Rs-AFP2在小麦抗病育种上的应用潜力，人工... 萝卜（Raphanus sativus）抗菌肽Rs—AFP2在体外强烈抑制小麦赤霉病菌（Fusarium graminenrum）、黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）、烟草赤星病（Alternaria longipes）的菌丝生长。为了研究Rs-AFP2在小麦抗病育种上的应用潜力，人工合成了Rs-AFP2基因。通过基因重组技术（包括限制性内切酶酶切和连接），将人工合成的R以FP2基因替代单子叶高效组成型表达栽体pAHC25中的GUS基因，构建了R￡AFP2基因的单子叶高效表达栽体pUAFP2。该栽体除携带受Ubiquitin启动子控制的Rs-AFP2基因表达盒外，还具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒，后者可为后续利用除草剂Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性；采用基因枪法轰击小麦品种扬麦12、济麦19、晋麦47和豫麦34幼胚共4042个，经过2～3次Bialaphos筛选，最终获得扬麦12再生植株316株；利用高效表达栽体pUAFP2的Bar和Rs-AFP2基因的特异引物对上述成活的转化植株进行PCR检测，获得Bar和Rs-AFP2基因均为阳性的植株58株，转化率为1．43％。 展开更多
关键词 萝卜抗菌肽rs-afp2 小麦 转基因 载体构建
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prp1-1调控Rs-AFP2诱导表达对增强辣椒疫霉菌抗性的研究(英文) 被引量：1
3
作者 黄真池 罗齐军 +1 位作者 欧阳乐军 曾富华 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期892-897,共6页
病原物诱导型启动子能精确控制抗病基因在侵染位点的表达,是抗病基因工程的有效工具。prp1-1是来自马铃薯谷胱甘肽巯基转移酶基因启动子的一个273bp的片段,能够快速准确地启动被侵染位点抗病基因的表达;Rs-AFP2是具有对致病性丝状真菌... 病原物诱导型启动子能精确控制抗病基因在侵染位点的表达,是抗病基因工程的有效工具。prp1-1是来自马铃薯谷胱甘肽巯基转移酶基因启动子的一个273bp的片段,能够快速准确地启动被侵染位点抗病基因的表达;Rs-AFP2是具有对致病性丝状真菌的广谱抗性。该研究构建prp1-1调控Rs-AFP2基因表达的载体,经农杆菌介导转化法导入辣椒。逆转录PCR检测发现,转基因辣椒只在受到疫霉菌孢子侵染时,才由prp1-1启动Rs-AFP2基因的转录。用疫霉菌孢子灌根接种转基因辣椒T1代植株,35株T1代辣椒中有29株表现出明显的疫霉菌抗性。另将23株T1代辣椒种于人工气候箱,发现其形态和发育特征与相同条件下的非转基因植株无明显区别。研究表明,prp1-1调控Rs-AFP2的诱导表达达到了增强辣椒疫霉菌抗性的目的,而且避免了负面效应的发生。 展开更多
关键词 辣椒 prp1-1 rs-afp2 疫霉菌
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抗菌肽Rs-AFP_2的原核表达及抑菌活性 被引量：10
4
作者 路妍 刘宝业 +1 位作者 井金学 张增艳 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期84-88,共5页
为了明确人工合成的萝卜抗菌肽Rs-AFP2基因编码产物是否对一些重要农作物病原真菌有抑制作用,本文将该基因编码序列亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建成GST-Rs-AFP2融合蛋白表达载体。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了... 为了明确人工合成的萝卜抗菌肽Rs-AFP2基因编码产物是否对一些重要农作物病原真菌有抑制作用,本文将该基因编码序列亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建成GST-Rs-AFP2融合蛋白表达载体。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了以包涵体形式表达的GST-Rs-AFP2重组蛋白。经过裂解、洗涤、溶解、复性、离心等处理,获得了纯化的GST-Rs-AFP2融合蛋白。对重要作物病原真菌进行体外抑菌分析的结果表明,Rs-AFP2可以显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌的菌丝生长,说明Rs-AFP2可作为上述植物病害抗性基因育种的潜在基因。 展开更多
关键词 抗菌蛋白rs-afp2 复性 抑制真菌 植物病原真菌
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抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响
5
作者 朱建清 刘柱 +1 位作者 胡新文 杨志荣 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第4期18-23,共6页
为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨... 为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比,在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA),第5号氨基酸Gln相差一个碱基(CAG→CAA),第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物,将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b(+)分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后,二者均得到了表达。软件分析显示,突变前pETAFPo表达产物占全菌蛋白的3％,突变后pETAFPm的表达产物占全菌蛋白含量的8％;表达蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经超声波破碎后,蛋白质复性,抑菌结果表明,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比,已有效地提高表达量。 展开更多
关键词 萝卜抗真菌蛋白2 rs-afp2 定点突变 密码偏爱性 基因表达 大肠杆菌 遗传密码子 基因突变
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萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达
6
作者 刘柱 胡新文 +1 位作者 朱建清 杨志荣 《西南农业学报》 CSCD 2002年第3期85-89,共5页
根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs AFP2 基因序列 ,结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性 ,人工合成引物 ,利用PCR重叠延伸法 ,使编码序列区的部分核苷酸突变 ,采用嵌套PCR ,迅速克隆到目的基因片段Rs AFPm ,连接到 pGEM Teasy载体上 ,... 根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs AFP2 基因序列 ,结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性 ,人工合成引物 ,利用PCR重叠延伸法 ,使编码序列区的部分核苷酸突变 ,采用嵌套PCR ,迅速克隆到目的基因片段Rs AFPm ,连接到 pGEM Teasy载体上 ,转化大肠杆菌XL1菌株 ,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明 ,PCR产物全长 2 40bp ,有一个阅读框 ,编码 2 9个氨基酸的信号肽和 5 1个氨基酸的抗真菌蛋白 ,与突变前的Rs AFP2 基因相比 ,在编码区第 3号氨基酸Lys相差一个碱基 (TTG→TTA) ,第 5号氨基酸Gln相差一个碱基 (CAG→CAA) ,第 6号稀有密码Arg相差两个碱基 (CAG→CGA) ,但二者编码产生相同。重新合成引物 ,将切除信号肽的Rs AFP2 基因和Rs AFPm基因分别克隆到pET 2 1b(+ )质粒载体上 ,导入大肠杆菌BL2 1菌株。Tricine SDS PAGE电泳显示工程菌中存在 6KD左右的目的蛋白带 ;软件分析显示 ,突变后pETAFPm的表达产物约为突变前 pETAFPo表达产物的2倍 ;抑菌结果表明 ,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于 pETAFP2 表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs AFPm基因与Rs AFP2 基因相比 ,已有效的提高表达量。 展开更多
关键词 大肠杆菌 密码偏爱性 PCR定点突变 萝卜抗真菌蛋白 rs-afp2 基因表达
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几丁质酶基因与抗真菌蛋白基因、葡聚糖酶基因双价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组 被引量：4
7
作者 王华 周鹏 郭安平 《西北植物学报》 CAS CSCD 2002年第2期250-256,共7页
几丁质酶 (Chitinase,Chi.)、β- 1 ,3 -葡聚糖酶 (β- 1 ,3 - Glucanase,Glu.)和萝卜抗真菌蛋白 (Rs- AFP2 )是植物体内正常的表达产物 ,它们对防御植物的真菌病害具有重要的作用。基于它们在功能上具有协同作用 ,本研究利用基因工程... 几丁质酶 (Chitinase,Chi.)、β- 1 ,3 -葡聚糖酶 (β- 1 ,3 - Glucanase,Glu.)和萝卜抗真菌蛋白 (Rs- AFP2 )是植物体内正常的表达产物 ,它们对防御植物的真菌病害具有重要的作用。基于它们在功能上具有协同作用 ,本研究利用基因工程技术构建了几丁质酶和抗真菌蛋白、几丁质酶和葡聚糖酶双价表达载体 ,通过农杆菌直接转化技术将双价表达载体转入农杆菌EH A1 0 5 ,最后采用 PCR、DNA dot 展开更多
关键词 几丁质酶 葡聚糖酶 抗真菌蛋白 双价表达载体 农杆菌工程菌株 重组
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