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猴樟CbbHLH96基因启动子克隆与表达
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作者 张丽华 韩浩章 +4 位作者 赵荣 李素华 王芳 张楠 王晓立 《东北林业大学学报》 北大核心 2025年第4期23-29,46,共8页
转录因子CbbHLH96参与猴樟响应碱胁迫过程,为弄清CbbHLH96参与植物耐碱胁迫的工作模式和信号传递途径,采用PCR技术克隆获得CbbHLH96基因5’端缺失型启动子片段,采用双荧光素酶报告基因技术分析外源茉莉酸甲酯、水杨酸和ABA处理后的启动... 转录因子CbbHLH96参与猴樟响应碱胁迫过程,为弄清CbbHLH96参与植物耐碱胁迫的工作模式和信号传递途径,采用PCR技术克隆获得CbbHLH96基因5’端缺失型启动子片段,采用双荧光素酶报告基因技术分析外源茉莉酸甲酯、水杨酸和ABA处理后的启动子片段表达活性。研究表明:获得的CbbHLH96基因启动子片段长为1976 bp;顺式作用元件分析发现CbbHLH96基因启动子片段中包含光响应调控元件、茉莉酸甲酯响应调控元件、ABA响应元件、乙烯响应元件、干旱诱导响应元件、赤霉素响应元件、防御和应激反应元件、水杨酸响应元件;采用双荧光素酶报告基因技术分析发现,bHLH96-Luc3、bHLH96-Luc4片段具备最高的启动子活性;BDGP在线软件的分析发现,CbbHLH96基因启动子序列的转录起始位点及可能的核心启动子区域应该在bHLH96-Luc4片段的1593~1643 bp位置;水杨酸和茉莉酸甲酯处理均抑制启动子片段bHLH96-Luc3、bHLH96-Luc4的表达活性,ABA处理则增加了启动子片段bHLH96-Luc3的表达活性,抑制了bHLH96-Luc4的表达活性。CbbHLH96基因启动子序列的活性区域在bHLH96-Luc3、bHLH96-Luc4片段,转录因子CbbHLH96功能受水杨酸和茉莉酸甲酯代谢的负向调控,受ABA代谢途径的正向调控。 展开更多
关键词 CbbHLH96基因启动子 表达分析 双荧光素酶报告基因技术 猴樟
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增值与减负:超大城市基层治理的数据驱动逻辑——基于C市J区的案例研究
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作者 锁利铭 卫荷宁 《上海行政学院学报》 北大核心 2025年第6期26-36,共11页
数字化减负是破解超大城市基层治理困境、推进城市治理现代化的关键举措。然而在数字化减负实践中,“数字悬浮”“效能内耗”等问题逐渐显现,减负效果不合预期。其潜在诱因之一,在于实施者在基层治理中对技术与数据的功能差异认知不足... 数字化减负是破解超大城市基层治理困境、推进城市治理现代化的关键举措。然而在数字化减负实践中,“数字悬浮”“效能内耗”等问题逐渐显现,减负效果不合预期。其潜在诱因之一,在于实施者在基层治理中对技术与数据的功能差异认知不足。案例分析表明,以“报表通”系统为代表的创新探索,本质上是依托数据要素构建起的数据增值动力系统。其运转机理体现在三个维度的协同演进:以数据价值型组织为核心,以数据存用型设施为载体,以数据集体性智能为引领。当数据与行政耦合催生的变体,形成结构效应、规模效应与涌现效应的协同动力时,超大城市所蕴含的数据价值便能有效释放,基层负担也有望在动态调适过程中自然消解。研究提出超大城市基层减负的数字化转型应从“技术赋能”转向“数据增值”,尝试为破解数字形式主义提供一个新的认知视角。 展开更多
关键词 超大城市 基层减负 数据治理 报表通
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人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体的构建及鉴定 被引量:2
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作者 卫艳萍 马云云 +3 位作者 何婷玉 冯龙 郭文涛 赵国强 《山东医药》 CAS 北大核心 2009年第43期29-31,共3页
目的构建并鉴定人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体,为AIDS的靶向基因治疗奠定基础。方法利用PCR技术扩增人CXCR4基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-neo,构建含CXCR4启动子的萤光素酶表达载体pGL3-neo-CXC... 目的构建并鉴定人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体,为AIDS的靶向基因治疗奠定基础。方法利用PCR技术扩增人CXCR4基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-neo,构建含CXCR4启动子的萤光素酶表达载体pGL3-neo-CXCR4,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。再将构建的载体用脂质体转染体外培养的Jurkat细胞株,检测萤光素酶的表达活性。结果扩增得到CXCR4基因启动子序列,克隆入pGL3-neo-CXCR4的CXCR4基因启动子序列与GenBank报道的一致,实验组(pGL3-neo-CXCR4组)萤光素酶的表达活性为869 159.0±62 618.8,与空白组(未转染组)的464.2±44.0和对照组(pGL3-neo组)的39 088.4±3867.9相比,差异有统计学意义(F=1415.124,P均<0.05)。结论成功构建了含人CXCR4基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3-neo-CXCR4。 展开更多
关键词 CXCR4 启动子 萤光素酶报告载体
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孤儿受体TR3与人CNTF受体基因中顺式元件作用机制的研究 被引量:6
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作者 穆小民 刘以训 张传祥 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第5期485-491,共7页
应用两对人工合成的寡核苷酸引物,分别通过PCR扩增,得到了CNTFRα-I5NBRE序列两侧的两个扩增片段,将其和在EcoRⅤ位点切开的pT7blue一起定向连接,得到了插入在pT7blue的EcoRⅤ位点的缺失了N... 应用两对人工合成的寡核苷酸引物,分别通过PCR扩增,得到了CNTFRα-I5NBRE序列两侧的两个扩增片段,将其和在EcoRⅤ位点切开的pT7blue一起定向连接,得到了插入在pT7blue的EcoRⅤ位点的缺失了NBRE序列的CNTFRα-I5,然后再将其切下,插入到具有SV40起动子的CAT基因表达载体的BglⅡ位点,构建了CAT报道基因.细胞转染和CAT实验表明,缺失NBRE后,CNTFRα-I5仍具有增强子功能,TR3通过该增强子对CNTFRα的表达具有诱导作用,说明这种诱导作用并不是单一通过NBRE序列进行的. 展开更多
关键词 孤儿受体TR3 报道基因 表达调控 CNTF受体基因
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食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达 被引量:17
5
作者 孙强正 熊衍文 +1 位作者 叶长芸 徐建国 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期293-298,共6页
为构建乳酸乳球菌食品级分泌表达载体,通过PCR扩增质粒pMG36e的p32启动子片段及乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)基因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前11个氨基酸的编码序列(SPusp45),克隆到食品级载体pSH91中,构建食品级分... 为构建乳酸乳球菌食品级分泌表达载体,通过PCR扩增质粒pMG36e的p32启动子片段及乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)基因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前11个氨基酸的编码序列(SPusp45),克隆到食品级载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQ;克隆报告基因金黄色葡萄球菌核酸酶(NucA)成熟肽的编码序列nucA到pSQ中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建了乳酸乳球菌食品级分泌性表达系统Llactis/pSQ-nucA;通过TB-D法和酶谱法检测Llactis/pSQ-nucA的表达形式、表达量并与以前构建的Llactis/pSQZ-nucA系统表达能力进行比较,结果发现Llactis/pSQ-nucA能够分泌性表达NucA,分泌性表达的NucA量大约是胞内NucA的10倍;Llactis/pSQ-nucA的表达量高于lactis/pSQZ-nucA。为进一步目的蛋白的的分泌性表达及食品级疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 p32启动子 食品级载体 分泌性表达 报告蛋白
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农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立 被引量:7
6
作者 刘雪梅 王蕾 +2 位作者 文添龙 何鹏 俞嘉宁 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期587-594,共8页
植物瞬时表达系统在研究功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作、启动子活性等方面具有重要作用。选取棉花(Gossypium hirsutum)子叶为材料,以β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)为报告基因,对棉花子叶生长时间、农杆菌... 植物瞬时表达系统在研究功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作、启动子活性等方面具有重要作用。选取棉花(Gossypium hirsutum)子叶为材料,以β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)为报告基因,对棉花子叶生长时间、农杆菌浓度、注射量、共培养时间等因素进行了分析,建立了农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统。结果表明,对萌发6天的棉花子叶注射50μLOD600为0.5的含目的基因的农杆菌LBA4404或GV3101,共培养2–3天后,外源基因表达效率最高。利用此方法从棉花萌发到观测结果,仅需8–13天,且操作简单易行,可快速检测棉花来源的启动子活性、亚细胞定位、蛋白质互作等。该方法在棉花基因功能研究方面有很好的应用价值。 展开更多
关键词 棉花 基因功能研究 报告基因 瞬时表达
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乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达 被引量:5
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作者 孙强正 熊衍文 +1 位作者 叶长芸 徐建国 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期224-228,275,共6页
目的构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)方法PCR扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pS... 目的构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)方法PCR扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQZ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的编码序列nucA到pSQZ中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ-nucA;采用TB-D法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA活性。结果PCR扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pSH91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA基因片段克隆入载体pSQZ并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ-nucA。在TB-D平板上,L lactis MBP71/pSQZ-nucA克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ-nucA上清和菌体在18kDa位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。结论成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 食品级载体 分泌性表达 报告蛋白
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肝细胞癌高表达基因TPT1真核报告表达载体的构建及鉴定 被引量:2
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作者 高天慧 段芳龄 +5 位作者 马军 周云 孙嫣 孙艳 王晓 薛乐勋 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2005年第3期268-271,共4页
目的构建TPT1真核报告表达载体pEGFPN3TPT1,为进一步研究其功能奠定基础。方法通过PCR和酶切的方法获取具有黏性末端的TPT1基因的全长开放读码框,将其定向连入真核表达载体pEGFPN3绿色荧光报告基因的氨基侧,构成pEGFPN3TPT1的真核报告... 目的构建TPT1真核报告表达载体pEGFPN3TPT1,为进一步研究其功能奠定基础。方法通过PCR和酶切的方法获取具有黏性末端的TPT1基因的全长开放读码框,将其定向连入真核表达载体pEGFPN3绿色荧光报告基因的氨基侧,构成pEGFPN3TPT1的真核报告表达载体,通过酶切和测序鉴定TPT1的正确插入。结果酶切和测序均证实TPT1正确插入了真核报告表达载体pEGFPN3TPT1中。结论成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFPN3TPT1。 展开更多
关键词 高表达基因 肝细胞癌 鉴定 真核表达载体 开放读码框 T1基因 报告基因 步研究 酶切 PCR 插入 测序
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β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在大型经济海藻裙带菜中的瞬间表达 被引量:6
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作者 于道展 秦松 +1 位作者 孙国琼 曾呈奎 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2002年第8期93-95,共3页
用高压氦气式基因枪将SV4 0启动子驱动下的 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中 ,4 8小时后染色检测 ,在假根、孢子叶和叶片中均检测到了lacZ的瞬间表达。研究还发现 ,对于裙带菜组织块的基因枪法转... 用高压氦气式基因枪将SV4 0启动子驱动下的 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中 ,4 8小时后染色检测 ,在假根、孢子叶和叶片中均检测到了lacZ的瞬间表达。研究还发现 ,对于裙带菜组织块的基因枪法转化 ,压强130 0psi优于 110 0psi。另外在裙带菜中没有发现半乳糖苷酶的染色本底。本文结果提示 :基因枪法是有效的裙带菜遗传转化方法 ;lacZ可以作为裙带菜基因工程研究的报告基因 ,SV4 0启动子能有效驱动外源基因在裙带菜中表达 ,没有组织特异性。这是lacZ在裙带菜中表达的首次报道 。 展开更多
关键词 Β-半乳糖苷酶基因 大型经济海藻 裙带菜 LACZ SV40启动子 基因枪法 瞬间表达 培育 基因工程
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绿色荧光蛋白标记的D氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文) 被引量:2
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作者 何志颖 江千里 +6 位作者 陈元晓 温丽敏 姚玉成 王新民 李文林 王健民 胡以平 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第11期1175-1181,共7页
为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细... 为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 D-氨基酸氧化酶 自杀基因 报告基因 基因表达 宫颈癌
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四种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞(Bm-e-HNU5)内的瞬时表达 被引量:6
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作者 王云 叶向群 +2 位作者 吴亦亮 桂慕燕 左正宏 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期167-171,共5页
以红色荧光蛋白基因(RFP)为报告基因,构建含4种不同启动子的重组表达质粒,用脂质体介导法转染家蚕Bombyxmori细胞(Bm-e-HNU5),观察家蚕细胞质肌动蛋白4基因启动子(A4)、α微管蛋白基因启动子(α-tub)、蚕丝心蛋白重链基因启动子(Fib)和... 以红色荧光蛋白基因(RFP)为报告基因,构建含4种不同启动子的重组表达质粒,用脂质体介导法转染家蚕Bombyxmori细胞(Bm-e-HNU5),观察家蚕细胞质肌动蛋白4基因启动子(A4)、α微管蛋白基因启动子(α-tub)、蚕丝心蛋白重链基因启动子(Fib)和家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子(IE)4种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达情况。构建的重组表达质粒pDsRed-α-tub、pDsRed-A4、pDsRed-IE和pDsRed-Fib经双酶切和PCR鉴定正确无误。转染和转录实验结果表明,除了pDsRed-A4外,其他3种重组质粒在Bm-e-HNU5细胞中都得到高转染率,α-tub、IE和Fib可依次增强RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达活性。 展开更多
关键词 家蚕 启动子 RFP报告基因 瞬时表达活性 脂质体介导法
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利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平 被引量:3
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作者 陈斌 李建彬 +10 位作者 米志强 安小平 李存 刘大斌 姜焕焕 王娟 黄芬 张宝中 范华昊 何后军 童贻刚 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期92-96,共5页
目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后... 目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后,结果检测不到报告基因的表达。为了提高报告基因的表达水平,将报告基因的读码框向后移动一个碱基,同时在其上游增加一个终止密码子,然后检测报告基因的表达水平。结果:通过移动报告基因的读码框同时在上游增加终止密码子,使报告基因的表达水平大大提高。结论:在构建基因表达载体时,通过改变目的基因与上游起始密码子ATG之间的相对位置以及增加终止密码子,可以大幅提高目的基因的表达水平。 展开更多
关键词 慢病毒载体 报告基因 基因表达 定点突变
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GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达 被引量:1
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作者 邢俊平 杨宇 +2 位作者 王全颖 杨广笑 邱曙东 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期316-319,共4页
目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此... 目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 报告基因 表达
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绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 被引量:2
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作者 霍海龙 赵跃 +6 位作者 王锐 侯慧芳 李卫真 张永云 刘丽仙 王配 霍金龙 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期820-825,共6页
为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,... 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因克隆 报告基因 原核表达
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核基质结合区的位置对转基因表达的影响 被引量:3
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作者 张俊河 昝玉玺 王天云 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期839-843,共5页
为研究核基质结合区(MAR)序列不同插入位置对转基因表达作用的影响,PCR扩增人β-珠蛋白MAR分别插入到含氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)报告基因真核表达载体pCATG表达盒两侧、5′端及3′端.酶切鉴定后,用阳... 为研究核基质结合区(MAR)序列不同插入位置对转基因表达作用的影响,PCR扩增人β-珠蛋白MAR分别插入到含氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)报告基因真核表达载体pCATG表达盒两侧、5′端及3′端.酶切鉴定后,用阳离子聚合物转染CHO细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,ELISA分析CAT基因的表达水平,半定量PCR分析CAT基因相对拷贝数.结果表明,表达盒两侧含MAR序列的载体能提高介导的转基因表达水平平均提高10.4倍,5′端含MAR序列的载体表达水平平均提高3.9倍,3′端含MAR序列的载体反而降低转基因表达水平.5′端含MAR序列的表达载体其转基因相对拷贝数高于其它两组载体的基因拷贝数,转基因表达量与基因拷贝数不成正比. 展开更多
关键词 核基质结合区 插入位置 转基因表达 报告基因
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hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达 被引量:1
16
作者 何才姑 朴英杰 +1 位作者 郑文岭 胡莲美 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期904-906,共3页
目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体... 目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。 展开更多
关键词 基因真核表达载体 增强绿色荧光蛋白 EGFP基因 pESC 重组真核表达 URA 酿酒酵母 大肠杆菌 融合蛋白 报告基因 亚克隆 栽体 转化
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eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证 被引量:4
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作者 吴学龙 何海燕 +1 位作者 刘智宏 黄锐之 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第4期645-650,共6页
绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增... 绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。 展开更多
关键词 eGfp/Gus双报告基因 植物表达载体 瞬时表达 转基因表达
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NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定 被引量:5
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作者 许丽艳 李恩民 +2 位作者 蔡唯佳 沈忠英 曾毅 《癌变·畸变·突变》 CAS CSCD 2004年第1期5-8,共4页
背景与目的:构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5’侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431-+84)。PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克... 背景与目的:构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5’侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431-+84)。PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic。重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定。结果:成功构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-G0-G6。结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5’侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件。 展开更多
关键词 NGAL基因 基因表达调控 荧光素酶 报告基因 载体构建
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高等院校农林专业基因工程实验教学改革探索与实践 被引量:2
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作者 段永波 赵丰兰 +2 位作者 宋运贤 盛玮 薛建平 《安徽农业科学》 CAS 2014年第35期12780-12781,共2页
针对基因工程实验课程基于分子水平操作难以获得较好教学效果的问题,利用报告基因,以基因表达框的启动子和目的基因2个重要元件为切入点,在有限的教学课时内完成克隆真核生物基因启动子和报告基因并成功实现了报告基因在真核细胞中的表... 针对基因工程实验课程基于分子水平操作难以获得较好教学效果的问题,利用报告基因,以基因表达框的启动子和目的基因2个重要元件为切入点,在有限的教学课时内完成克隆真核生物基因启动子和报告基因并成功实现了报告基因在真核细胞中的表达。以此改变该课程主要以验证为主,且实验结果主要以单一的酶切图谱形式展示而不够直观的问题,进而提高了教学效果。 展开更多
关键词 基因工程实验 启动子 报告基因 生菜瞬时表达
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绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达 被引量:5
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作者 于丽莉 陈诗书 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2000年第5期408-411,共4页
目的在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)为标记基因的合适条件。 方法用带有GFP突变体的质粒转染到表达细胞 ,观察GFP瞬时表达的情况 :1 直接测定GFP在COS- 7细胞中的表达并观察表达的稳定性... 目的在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)为标记基因的合适条件。 方法用带有GFP突变体的质粒转染到表达细胞 ,观察GFP瞬时表达的情况 :1 直接测定GFP在COS- 7细胞中的表达并观察表达的稳定性 ;2 比较不同启动子驱动的 pcDNA3 - EGFP和 pSVK3 -S6 5T两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率 ;3 用LacZ基因与GFP基因共转染 48h后 ,通过FACS分选测定两种基因在同一细胞中的表达情况。 结果在不同条件下的活细胞中有GFP基因表达 ,且表达具有稳定性 ,表达持续约 2周左右 ;CMV启动子和SV4 0 启动子调控的GFP对不同肿瘤细胞株的转染效率有差异。当两种基因共转染后用FACS分选 ,选出GFP细胞带有LacZ基因细胞在 1∶4时可达 85 %以上。 结论通过GFP表达可连续而直接地观察活细胞中的基因表达 ,利用GFP可快速地挑选带有靶基因的细胞。 展开更多
关键词 GFP表达 标记基因 肿瘤 基因治疗 绿色荧光蛋白
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