双生病毒严重危害农作物产量。双生病毒编码的复制起始蛋白(replication initiator protein,Rep)是病毒复制的必需蛋白。甜菜严重曲顶病毒(beet severe curly top virus,BSCTV)属于双生病毒科曲顶病毒属,其Rep蛋白可以诱导拟南芥E3泛素...双生病毒严重危害农作物产量。双生病毒编码的复制起始蛋白(replication initiator protein,Rep)是病毒复制的必需蛋白。甜菜严重曲顶病毒(beet severe curly top virus,BSCTV)属于双生病毒科曲顶病毒属,其Rep蛋白可以诱导拟南芥E3泛素化连接酶VIM5在叶片中表达,VIM5介导甲基转移酶通过泛素化途径降解,进而降低了BSCTV基因组C2-3启动子区域的甲基化水平,然而Rep蛋白中负责诱导VIM5的具体结构域并不清楚。一些双生病毒的Rep蛋白具有抑制基因沉默的功能,然而BSCTV编码的Rep蛋白是否具有沉默抑制活性尚不明确。本研究利用烟草瞬时表达系统,研究Rep蛋白的不同结构域在抑制基因沉默和诱导VIM5表达方面的功能。发现Rep蛋白N端结构域(第1-180个氨基酸)可以抑制外源GFP在16c-GFP转基因烟草注射叶片上的降解;进一步研究发现,Rep蛋白N端的第1-104个氨基酸可以显著诱导VIM5的表达,而Rep蛋白C端的结构则不能诱导VIM5的表达。本研究表明BSCTV编码的Rep蛋白的N端结构域能够抑制基因沉默同时诱导VIM5表达,有助于更加深入地理解双生病毒复制起始蛋白Rep和宿主植物的互作机制。展开更多
【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-...【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。展开更多
文摘双生病毒严重危害农作物产量。双生病毒编码的复制起始蛋白(replication initiator protein,Rep)是病毒复制的必需蛋白。甜菜严重曲顶病毒(beet severe curly top virus,BSCTV)属于双生病毒科曲顶病毒属,其Rep蛋白可以诱导拟南芥E3泛素化连接酶VIM5在叶片中表达,VIM5介导甲基转移酶通过泛素化途径降解,进而降低了BSCTV基因组C2-3启动子区域的甲基化水平,然而Rep蛋白中负责诱导VIM5的具体结构域并不清楚。一些双生病毒的Rep蛋白具有抑制基因沉默的功能,然而BSCTV编码的Rep蛋白是否具有沉默抑制活性尚不明确。本研究利用烟草瞬时表达系统,研究Rep蛋白的不同结构域在抑制基因沉默和诱导VIM5表达方面的功能。发现Rep蛋白N端结构域(第1-180个氨基酸)可以抑制外源GFP在16c-GFP转基因烟草注射叶片上的降解;进一步研究发现,Rep蛋白N端的第1-104个氨基酸可以显著诱导VIM5的表达,而Rep蛋白C端的结构则不能诱导VIM5的表达。本研究表明BSCTV编码的Rep蛋白的N端结构域能够抑制基因沉默同时诱导VIM5表达,有助于更加深入地理解双生病毒复制起始蛋白Rep和宿主植物的互作机制。
