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基于逆转录微滴式数字PCR的污水中SARS-CoV-2变异株检测方法的建立
1
作者 伍霞 张岚 +3 位作者 张晓 韩嘉艺 邢方潇 叶必雄 《环境卫生学杂志》 2025年第5期427-433,共7页
目的旨在建立检测和绝对定量新型冠状病毒(SARS-CoV-2)变异株的方法。方法以SARS-CoV-2变异株BF.7.14为例,针对变异株突变位点保守区域分别设计特异引物和探针,建立检测SARS-CoV-2的逆转录微滴式数字PCR(RT-ddPCR)方法,评价其特异性、... 目的旨在建立检测和绝对定量新型冠状病毒(SARS-CoV-2)变异株的方法。方法以SARS-CoV-2变异株BF.7.14为例,针对变异株突变位点保守区域分别设计特异引物和探针,建立检测SARS-CoV-2的逆转录微滴式数字PCR(RT-ddPCR)方法,评价其特异性、灵敏性和适用性等。结果方法在引物探针浓度分别为900、250 nmol/L,退火温度为52.5℃时优化结果最佳;建立的方法能够准确检出目标SARS-CoV-2变异株的同时,降低其他变异株的干扰;采用该建立的方法检测SARS-CoV-2变异株的定量限为0.28拷贝/μL;对18个实际样本分别进行RT-ddPCR和RT-qPCR检测,检出率均为100%(18/18),RT-ddPCR检出浓度范围为16~7648拷贝/mL,RT-qPCR检出浓度范围为14~4875拷贝/mL。结论RT-ddPCR方法能够很好地检测污水中SARS-CoV-2变异株。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 变异株 BF.7.14 rt-ddpcr
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微滴式数字PCR检测冷冻草莓中GⅠ、GⅡ型诺如病毒 被引量：5
2
作者 王雪晴 王群 +4 位作者 房保海 姜帆 岳志芹 孙涛 梁成珠 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第2期89-94,共6页
目的:建立一种检测冷冻草莓中诺如病毒(GⅠ和GⅡ)的逆转录微滴数字PCR(RT-ddPCR)方法。方法:根据ISO标准选定检测引物,优化反应体系,退火温度,进行了方法学实验,建立了一种快速检测冷冻草莓中GⅠ和GⅡ亚型诺如病毒的新方法。结果:确定... 目的:建立一种检测冷冻草莓中诺如病毒(GⅠ和GⅡ)的逆转录微滴数字PCR(RT-ddPCR)方法。方法:根据ISO标准选定检测引物,优化反应体系,退火温度,进行了方法学实验,建立了一种快速检测冷冻草莓中GⅠ和GⅡ亚型诺如病毒的新方法。结果:确定了数字PCR检测GⅠ型诺如病毒退火温度为56.5℃,GⅡ型诺如病毒退火温度为58.1℃。RT-ddPCR检测GⅠ质粒标准品标准曲线的R^2=0.9947,RT-ddPCR检测GⅡ质粒标准品标准曲线的R^2=0.9950,说明该方法具有良好的线性关系。与RT-qPCR灵敏度对比,RT-ddPCR法的灵敏度比RT-qPCR法高一个数量级。在检测范围内,最低检测限低至个位拷贝数。RSD最小为3.8%,表明该实验重复性良好。浓度较低100 copies/μL左右时,RT-ddPCR的重复性不佳。结论:本研究建立的诺如病毒数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于冷冻草莓中诺如病毒的定量检测。 展开更多
关键词 逆转录微滴数字PCR(rt-ddpcr) 诺如病毒 冷冻草莓
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一步法微滴数字PCR检测生菜中GII型诺如病毒 被引量：12
3
作者 陈嘉茵 方苓 +4 位作者 吴诗微 唐书泽 张志强 李晖 吴希阳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期332-337,共6页
目的:采用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术和QX200 Droplet Digital PCR System,建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测生菜中GII型诺如病毒(norovirus geneg... 目的:采用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术和QX200 Droplet Digital PCR System,建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测生菜中GII型诺如病毒(norovirus genegroup II,NoV GII)的方法。方法:优化RT-ddPCR检测NoV GII的反应体系;通过10倍梯度稀释的NoV GII线性阳性质粒确定RT-ddPCR的检测范围;利用其他常见的肠道病毒核酸(非GII型诺如病毒)作为反应模板,与NoV GII核酸同时进行RT-ddPCR,判定反应体系的特异性,并通过不同时间多次检测样品的方式判断该检测方法的稳定性。采用ISO/TS 15216-1:2013食品中诺如病毒RNA提取方法,对人工染毒不同水平(高、中、低)的NoVGII生菜样品进行检测,同时研究去除抑制物前后对RT-ddPCR检测的影响,并与逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)进行检测回收率的对比,探究RT-ddPCR在食品中NoV GII快速与定量检测上的发展潜力与应用前景。结果:RT-ddPCR的最高检测限为8.47×104 copies/μL,最低检测限为2.12 copies/μL,RT-ddPCR扩增效率为95.44%,标准曲线相关系数为0.997 3。在不同浓度人工染毒生菜样品中,抑制物的存在对ddPCR回收率检测结果没有显著性差异。在高、中染毒浓度下,抑制物对RT-qPCR与RT-ddPCR回收率检测结果影响不显著。低浓度下,未去除抑制物的RT-qPCR法平均回收率仅1.43%,与去除抑制物后的RT-qPCR检测结果(平均回收率为9.71%)有显著差异,且与RT-ddPCR的检测结果(未去除抑制物的RT-ddPCR平均回收率为11.80%,去除抑制物后平均回收率为12.53%)存在显著性差异。结论:生菜抑制物对RT-ddPCR的检测影响不显著,利用RT-ddPCR可有效测出低浓度的受污染样品,避免用现有的RT-qPCR方法因抑制物带来的"假阴性"检测结果。本实验建立的RT-ddPCR方法能高效、灵敏地检测出受污染食品中NoV GII的低病毒含量,在食源性病毒检测中具有可观的发展潜力和应用前景。 展开更多
关键词 逆转录微滴数字聚合酶链式反应 一步法 GII型诺如病毒 生菜 回收率
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数字PCR技术检测感染者尿液中SARS-CoV-2的方法研究 被引量：2
4
作者 王志彬 罗庆 +3 位作者 李宝林 唐敏 张章 刘靳波 《西南医科大学学报》 2022年第4期301-307,共7页
目的建立灵敏和准确可靠的数字PCR反应体系,开发简单高效的临床检测SARS-CoV-2的分析方法,通过提高检出限,为大规模爆发的传染性疾病快速诊断提供解决方案。方法提取12例病人咽拭子和尿液样本中的总RNA,以反转录后的cDNA为模板配制反应... 目的建立灵敏和准确可靠的数字PCR反应体系,开发简单高效的临床检测SARS-CoV-2的分析方法,通过提高检出限,为大规模爆发的传染性疾病快速诊断提供解决方案。方法提取12例病人咽拭子和尿液样本中的总RNA,以反转录后的cDNA为模板配制反应体系,经过油滴发生器将反应体系分割成油滴并进行PCR扩增,再结合荧光读取,分析检测样本中阳性核酸片段的数量。制备包含SARSCoV-2病毒核酸片段共2983 bp的阳性质粒,以10倍系列稀释液为模板进行RT-qPCR反应,根据标准质粒扩增结果制备标准曲线,通过标准曲线计算未知样本目的片段数量,比较ddPCR与RT-qPCR检测结果的准确性。以尿液为实验材料,检测阳性感染者尿液中病毒核酸拷贝数。结果12份阳性尿液标本检出率为75%,最低检出限为5.4 copies/μL,与常规RT-qPCR相比灵敏度显著提高。结论ddPCR方法准确、快速,且灵敏度高,可以满足尿液标本中低拷贝核酸的快速检出。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2 微滴式数字PCR 咽拭子 尿液 实时荧光定量PCR
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