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H1亚型禽流感病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用 被引量：3
1
作者 曾婷婷 李孟 +9 位作者 谢芝勋 李丹 谢丽基 罗思思 张民秀 王盛 谢志勤 范晴 阮志华 粟永春 《江西农业学报》 CAS 2024年第3期61-66,共6页
以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间... 以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间,利用侧向流动免疫(LFD)试纸条观测反应后的结果,最终建立检测H1亚型AIV的RT-RPA-LFD快速检测方法。结果表明:建立的RT-RPA-LFD快速检测方法在探针工作浓度为0.14 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(2)copies/反应的H1亚型AIV RNA,其他常见家禽病原体未见阳性反应。该方法与RT-PCR及鸡胚分离鉴定测序结果完全一致,可满足H1亚型AIV临床快速鉴别诊断的需求,为基层兽医现场快速检测提供技术支撑。 展开更多
关键词 H1亚型AIV 等温扩增技术 快速检测 rt-rpa-lfd
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甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 王永江 乔奇 +4 位作者 王爽 赵付枚 田雨婷 张德胜 张振臣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期2781-2790,共10页
【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV... 【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。 展开更多
关键词 甘薯褪绿矮化病毒西非株系 逆转录酶重组酶聚合酶扩增 侧向流层析 快速检测 甘薯
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猪瘟病毒核酸RT-RPA-LFD快速检测方法的建立 被引量：6
3
作者 黄涛 李丹丹 +1 位作者 高慎阳 贾宁 《兽医导刊》 2021年第5期115-118,共4页
以猪瘟病毒(CSFV)5’端非编码区(5’UTR)为保守靶核酸序列,利用OLIGO7.0软件设计特异性扩增引物和标记探针,建立了可快速检测CSFV的反转录-重组酶扩增结合免疫侧流层析试纸检测方法(RT-RPA-LFD)。该方法在38℃下恒温30min内即可完成可... 以猪瘟病毒(CSFV)5’端非编码区(5’UTR)为保守靶核酸序列,利用OLIGO7.0软件设计特异性扩增引物和标记探针,建立了可快速检测CSFV的反转录-重组酶扩增结合免疫侧流层析试纸检测方法(RT-RPA-LFD)。该方法在38℃下恒温30min内即可完成可视化反应,特异性强敏感度高,与其他猪的重要病原无交叉反应。该方法的CSFV RNA检出限(LOD)为2.2×102 copies/μL。上述结果表明,本研究建立的CSFV RTRPA-LFD检测方法操作简单、快速且直观,对没有PCR仪的地区的猪瘟诊断防控具有重要现实意义。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 5’端非编码区 rt-rpa-lfd 恒温扩增
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黄颡鱼实时荧光RPA及侧向流RPA试纸条快速现场鉴定方法的建立与应用
4
作者 林玉 张旻 +11 位作者 王娜 何舜平 张辉 唐永凯 方成池 景宏丽 张浪 沙航 段志强 王宽 吕继洲 吴绍强 《水生生物学报》 北大核心 2025年第4期120-128,共9页
研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,... 研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析,针对COI基因保守区域,设计了特异性探针和引物。测试结果显示,在37℃条件下,实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测,且最低检测限可以达到102拷贝数/反应;而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷,能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测,两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此,研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法,拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势,具有良好的现场快速检测应用前景。此外,其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题,检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期,为水产品监管执法提供技术手段。 展开更多
关键词 快速物种鉴定 重组酶聚合酶扩增 实时荧光型RPA 侧向流RPA试纸条 黄颡鱼
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