反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测猪繁殖与呼吸综合征

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作者 于娜 赵爱云 +8 位作者 黄春媛 马佳镁 张紫薇 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 齐萌 曹宗喜 《新疆农业科学》 北大核心 2025年第3期748-753,共6页

【目的】针对PRRSV Nsp2基因建立反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。【方法】设计经典毒株和高致病毒株引物及探针,检测RT-RAA的敏感性及特异性等。【结果】方法与猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV Bartha-K61)、猪... 【目的】针对PRRSV Nsp2基因建立反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。【方法】设计经典毒株和高致病毒株引物及探针,检测RT-RAA的敏感性及特异性等。【结果】方法与猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV Bartha-K61)、猪流行性腹泻病毒(PEDV Purdue)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV LJX)的核酸均无交叉反应;方法对高致病性毒株最低检出限为1.71×10^(1) copies/μL,对经典株最低检出限为2.19×10^(3) copies/μL。高致病毒株方法敏感性为95.5%,特异性为100%;经典株方法敏感性为93.0%,特异性为100%,2种方法具有高度的一致性。【结论】建立的PRRSV RT-RAA荧光法可以区分2种不同的毒株并且特异性良好、灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖于呼吸综合征病毒 rt-raa NSP2基因 特异性 敏感性 高致病毒株 经典毒株

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猪塞内卡病毒RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法的建立及应用

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作者 李晨钰 沙洲 +10 位作者 郑辉 崔进 迟田英 陈峰 曹振山 张慧 戈胜强 魏荣 南福龙 古少鹏 尼博 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第2期195-203,共9页

建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引... 建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引物,筛选最适扩增引物、最佳反应温度、最优RT-RAA反应体系。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR反应体系。利用6种常见猪群病原核酸验证已建立方法特异性。用数字PCR标定的SVA cRNA标准品验证已建立方法敏感性。通过重复试验验证方法的稳定性。应用已建立的方法与临床样品进行符合检验。RT-RAA及CRISPR反应体系优化结果显示,RT-RAA反应温度为37℃,扩增效果最佳;从8条crRNA中筛选出crRNA 5检测信号最强。建立的RT-RAA-CRISPR Cas13a方法特异性好,与ASFV、PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV、PRV等常见猪群疫病均无交叉反应;方法敏感性高,对SVA最低检测限为0.86 copy/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光,重复性好;能够在50 min内完成临床样品检测,对临床检毕的6份阳性样品及58份阴性样品进行符合检测,结果表明检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立了一种高特异性、高敏感性的RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法,有望应用于SVA的现场快速检测。 展开更多

关键词 rt-raa CRISPR/Cas13a SVA

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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法

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作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页

玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多

关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(rt-raa)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条

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番茄斑驳花叶病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a的可视化检测方法的建立

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作者 董铮 赵振兴 +3 位作者 范奇璇 王思元 周涛 张永江 《植物病理学报》 北大核心 2025年第3期504-510,共7页

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)是近年来发现的一种新的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒,主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物,严重影响果实的产量和品质。本研究根据ToMMV编码外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶... 番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)是近年来发现的一种新的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒,主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物,严重影响果实的产量和品质。本研究根据ToMMV编码外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因,通过优化反应体系及特异性和灵敏度的验证,建立了ToMMV快速灵敏的可视化检测方法。优化结果显示,当报告基因FQ终浓度为300 nmol·L^(-1)、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)和1000 nmol·L^(-1)条件下检测效果最好,最终RT-RAA和CRISPR/Cas12a显色体系只需分别反应15 min,通过便携式蓝光照射设备可以直接观察到阳性信号。实际样品检测结果显示,本研究建立的检测技术可以在辣椒和番茄中检测到ToMMV。该方法可特异性检测ToMMV,对携带ToMMV样品的RNA检测灵敏度可达2.5 pg·μL^(-1),是RT-PCR检测灵敏度的100倍,可用于ToMMV快速灵敏的可视化检测。 展开更多

关键词 番茄斑驳花叶病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a 可视化检测

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李属坏死环斑病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立与应用

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作者 张晓琪 沈建国 +4 位作者 廖富荣 李为民 金雨洁 沙依旦·吾甫尔 郑璐平 《中国农业科学》 北大核心 2025年第12期2371-2381,共11页

【目的】利用逆转录重组酶介导的核酸等温扩增技术(reverse transcriptase recombinase-aided amplification,RT-RAA)结合CRISPR/Cas12a系统,建立李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化... 【目的】利用逆转录重组酶介导的核酸等温扩增技术(reverse transcriptase recombinase-aided amplification,RT-RAA)结合CRISPR/Cas12a系统,建立李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。【方法】依据PNRSV外壳蛋白(coat protein,CP)编码基因的保守序列,设计并筛选扩增效率高、特异性强的引物;针对引物和探针的浓度、扩增体系、反应温度和时间等条件进行优化,建立PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。利用该方法对PNRSV、李痘病毒(plum pox virus,PPV)、苹果花叶病毒(apple mosaic virus,ApMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)等李属植物常见病毒进行检测,验证方法的特异性;将PNRSV的总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR、RT-RAA以及RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法进行检测,比较3种方法的灵敏度;对口岸收集的31份疑似感染病毒的桃果实试验样品进行RT-RAA-CRISPR/Cas12a和RT-PCR方法检测,验证该可视化检测方法的实用性。【结果】成功建立了用于检测PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。最终体系优化结果为引物RT-RAA-PNRSV-F2/R2、荧光报告基因FQ、CRISPR-Cas12a、PNRSV-crRNA(CRISPR RNA,crRNA)的工作浓度分别为0.4μmol·L^(-1)、800、200、240 nmol·L^(-1),反应条件为41℃下反应45 min。该方法可特异性检测PNRSV,与李属植物常见病毒无交叉反应。对携带PNRSV的桃果实样品RNA的检测灵敏度,RT-RAA和RT-RAA-CRISPR/Cas12a分别可达3.06 pg·μL^(-1)和306 fg·μL^(-1),RT-RAA-CRISPR/Cas12a灵敏度是RT-RAA和RT-PCR的10倍。口岸收集的31份桃果实试验样品中,RT-PCR检出14份阳性样品,RT-RAA-CRISPR/Cas12a检出15份阳性样品,两者检测结果一致率基本一致。【结论】建立了PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法,该方法具有简便、快速、高灵敏度、高特异性和直观的特点,适用于现场快速检测PNRSV。 展开更多

关键词 李属坏死环斑病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a 可视化检测

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马尔堡病毒核酸RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

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作者 牛莉娟 张宇欣 +4 位作者 张子莫 曹增国 黄培 张海丽 王化磊 《病毒学报》 北大核心 2025年第5期1478-1487,共10页

马尔堡病毒病(Marburg virus disease,MVD)是由马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)引起的烈性人兽共患传染病,以病毒性出血热为主要特征,病死率高达24%~88%。埃及果蝠是该病毒的自然宿主,而人类及非人灵长类动物则是其主要感染对象。近年来... 马尔堡病毒病(Marburg virus disease,MVD)是由马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)引起的烈性人兽共患传染病,以病毒性出血热为主要特征,病死率高达24%~88%。埃及果蝠是该病毒的自然宿主,而人类及非人灵长类动物则是其主要感染对象。近年来,由于埃及果蝠活动频繁、经济全球化进程加快,MARV外溢风险不断加大。然而,目前全球尚无获批上市的针对MARV的疫苗或特效药物,因此,研发快速精准的MARV检测方法,对全球疫情防控、保障人类健康安全意义重大。本研究将逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)技术与CRISPR/Cas12a分子检测系统相结合,以MARV的NP基因为检测靶标,建立了一种高灵敏度、强特异性且高效便捷的MARV核酸可视化检测方法。结果表明,该方法最低可检测到4.9×10^(-1)copies/μL的MARV重组质粒,且与尼帕病毒RNA、埃博拉病毒RNA等多种病毒不存在交叉反应。本方法为MVD的早期诊断与防控提供了重要技术支撑,在临床诊断、疫情监测及公共卫生安全领域具有较高的应用价值。 展开更多

关键词 马尔堡病毒 核酸可视化检测 rt-raa CRISPR/Cas12a NP基因

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猪捷申病毒荧光RT-RAA检测方法的建立及应用 被引量：1

7

作者 孙志华 林青 +4 位作者 康龙滨 王隆柏 周伦江 俞道进 陈秋勇 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期130-133,共4页

为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 mi... 为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 min即可完成对PTV核酸扩增,最低检出限度为30.1 copies/μL;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)均无交叉反应;重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;23份临床样品检测显示PTV阳性率为21.74%(5/23),检测结果与RT-qPCR一致。说明建立的PTV荧光RT-RAA检测方法具有简便、高效、稳定等优点,为PTV的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多

关键词 猪捷申病毒 荧光逆转录重组酶介导等温扩增 检测方法

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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的猪流行性腹泻病毒检测方法的建立与初步应用

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作者 郑江涛 刘哲言 +2 位作者 王永富 青易 朱玲 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第4期1034-1042,共9页

【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双... 【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双读数功能的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化平台,并对其检测能力进行了评估。【结果】该方法可特异性检测PEDV,与猪德尔塔冠状病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,且检测灵敏度达到1 copy/µL;与行业标准RT-qPCR方法的检测结果相比,其符合率达到100%。【结论】建立的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化检测方法可在1 h内完成对PEDV的检测,为快速现场诊断和防控提供了有力的技术保障。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 反转录-重组酶介导等温核酸扩增技术 规律间隔成簇短回文重复序列-关联蛋白13a 可视化检测

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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的寨卡病毒检测方法的建立

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作者 张雅路 石耀强 +3 位作者 刘金胜 李世林 陈利民 杨春晖 《临床输血与检验》 2025年第3期393-401,共9页

目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的新发黄病毒,近期研究提示其可能通过输血途径传播。现有检测方法存在灵敏度不足及覆盖范围有限等问题,亟需开发适用于中小型实验室或现场筛查的便捷检测技术。方法本研究基于CRISPR/Cas... 目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的新发黄病毒,近期研究提示其可能通过输血途径传播。现有检测方法存在灵敏度不足及覆盖范围有限等问题,亟需开发适用于中小型实验室或现场筛查的便捷检测技术。方法本研究基于CRISPR/Cas13a系统联合逆转录重组酶介导链置换核酸扩增(RT-RAA)技术,建立并优化了一种胶体金试纸条检测法,用于ZIKV RNA的特异性识别。结果所构建的RT-RAA-CRISPR/Cas13a试纸条检测灵敏度达4 copies/μL,特异性为100%,可精准检测梯度浓度标准品及临床样本。对ZIKV阳性样本的检测符合率为100%,阴性符合率亦为100%。血浆样本检测的灵敏度、特异性、阳性预测一致性(positive predictive agreement,PPA)和阴性预测一致性(negative predictive agreement,NPA)均为100%。结论本研究成功开发了一种基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a技术的ZIKV快速可视化检测试纸条。该方法操作简便、灵敏度高、结果判读直观,为寨卡感染的现场筛查提供了可替代PCR检测的新型解决方案,特别适用于资源有限场景下的即时诊断需求。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas13a 逆转录重组酶介导链置换核酸扩增 寨卡病毒 即时检测

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猪流行性腹泻病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

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作者 仇德洋 王海燕 +3 位作者 郑佳 杜建才 陈昭 李桂梅 《中国动物检疫》 2025年第7期90-95,共6页

为开发一种可靠、简易、便捷的现场猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,基于反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,建立了用于现场检测PEDV的RT-RAA-LFD方法。根据PEDV N基因保守序列进行引物和探针设计,通过试验优选... 为开发一种可靠、简易、便捷的现场猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,基于反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,建立了用于现场检测PEDV的RT-RAA-LFD方法。根据PEDV N基因保守序列进行引物和探针设计,通过试验优选出一套引物及一条探针,同时对RT-RAA反应时间和温度条件进行优化。优化后的方法在37℃恒温反应15 min,即可实现对PEDV目的基因片段的有效扩增;与其他常见腹泻病毒无交叉反应,最低检测限为1.23×10^(1) copies/μL;对134份临床样品进行检测,阳性检出率为5.97%,与国标检测方法结果一致。结果表明,本研究建立的PEDV RT-RAA-LFD检测方法操作简便,结果特异、灵敏,不需要专业的实验室设备和实验人员,适用于在资源有限地区对PEDV的检测,能够满足基层临床工作人员的需求。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶介导等温扩增 侧向层析试纸条

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猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用 被引量：2

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作者 王恋春 郑辉 +7 位作者 张慧 沙洲 房琳琳 尼博 董雅琴 魏荣 崔进 郑泽中 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第20期63-68,74,共7页

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-tran... 为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 N基因 猪流行性腹泻 实时荧光rt-raa 检测方法

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猪流行性腹泻病毒荧光RT-RAA检测方法的建立及初步应用 被引量：1

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作者 侯恩慧 陈秋勇 +6 位作者 吴学敏 丘镜莉 吴仁杰 周伦江 刘玉涛 马玉芳 王隆柏 《福建农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期1146-1151,共6页

【目的】建立一种快捷、灵敏、简便检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的RT-RAA检测方法,以提高猪流行性腹泻病毒临床检测效率。【方法】针对PEDV S基因片段保守区设计引物和探针,构建标准质粒PEDV-S,通过特... 【目的】建立一种快捷、灵敏、简便检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的RT-RAA检测方法,以提高猪流行性腹泻病毒临床检测效率。【方法】针对PEDV S基因片段保守区设计引物和探针,构建标准质粒PEDV-S,通过特异性、敏感性、重复性测定及条件优化,建立检测PEDV重组酶介导链置换核酸扩增荧光法(RT-RAA)。【结果】在42℃恒温作用20 min的条件下,建立的检测方法对检测猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)等猪源病毒均为阴性,猪流行性腹泻病毒(PEDV)为阳性;最低检出限为4.43×10^(2)拷贝·μL^(-1)的标准质粒;重复性结果显示,相同浓度标准质粒的差异性很小;利用建立的RT-RAA方法检测40份猪病毒样本,阳性率为7.5%(3/40),与实时荧光定量PCR检测结果相同。【结论】本研究建立的PEDV RT-RAA检测方法具有快速简便、耗时短、特异性高、灵敏度强和重复性好等特点,适用于对PEDV的快速诊断。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 rt-raa

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基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立 被引量：4

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作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(rt-raa) CRISPR/Cas12系统

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辣椒轻斑驳病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立 被引量：3

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作者 赵振兴 范奇璇 +3 位作者 王思元 董铮 胡中泽 张永江 《河南农业科学》 北大核心 2024年第9期80-87,共8页

辣椒是重要的园艺作物,辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全。为提高PMMoV的防控效率,根据其编码外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因保守序列,基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombina... 辣椒是重要的园艺作物,辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全。为提高PMMoV的防控效率,根据其编码外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因保守序列,基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase?aided amplification,RAA),设计了特异性RAA引物,实现对PMMoV的快速等温扩增,并基于CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物。优化结果显示,总反应体系在报告基因FQ终浓度为400 nmol/L,Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol/L和1000 nmol/L条件下检测信号最强,最终的RT-RAA反应和CRISPR显色体系分别仅需15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测PMMoV,对携带PMMoV的辣椒样品RNA的检测极限可达到1.34 pg/μL,分别是普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测灵敏度的1000倍和10倍。对实际样品中的检测结果显示,建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测技术可以在PMMoV侵染的辣椒和番茄叶片、果实及土壤中检测到PMMoV,可用于辣椒轻斑驳病毒的快速、灵敏、可视化检测。 展开更多

关键词 辣椒轻斑驳病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a 可视化检测

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RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测番茄褐色皱纹果病毒 被引量：1

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作者 赵振兴 范奇璇 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《植物检疫》 2024年第3期14-20,共7页

番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)严重威胁番茄等茄科园艺作物的生产安全。本研究根据其外壳蛋白(coat protein,CP)基因及其同属病毒的差异序列,设计了特异性重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided ... 番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)严重威胁番茄等茄科园艺作物的生产安全。本研究根据其外壳蛋白(coat protein,CP)基因及其同属病毒的差异序列,设计了特异性重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)引物,并基于CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了靶向RT-RAA扩增产物的CRISPR RNA(crRNA)。通过优化获得了检测信号最强的反应体系,其中报告基因FQ终浓度为600nmol/L、Cas12a和crRNA终浓度分别为200nmol/L和1000nmol/L,最终总反应时间仅为30 min。该方法可特异性检测ToBRFV,对携带ToBRFV的番茄样品RNA检测灵敏度为RT-PCR和RT-qPCR的10000和100倍,检测限为3.46fg/μL。阳性样品验证结果显示,本研究建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测技术可以在不同来源的辣椒、番茄侵染的植物叶片、果实及种子中检测到ToBRFV,表明该技术可用于番茄褐色皱纹果病毒的快速、灵敏的可视化检测。 展开更多

关键词 番茄褐色皱纹果病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a 可视化检测

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检测牛肠道病毒RT-RAA-LFD方法的建立与初步应用 被引量：1

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作者 张福慧 郑学博 +5 位作者 崔续媛 章凡 张芷源 胡俊英 张群 王新平 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期2348-2355,共8页

本研究研发了一种基于重组酶介导核酸扩增(RAA)技术结合胶体金试纸条快速检测牛肠道病毒(BEV)的方法。以高度保守的BEV 5′UTR作为靶序列,设计出特异性引物,下游引物5′端标记生物素,探针5′端标记6-FAM,初步建立RT-RAA方法。将鼠源抗6-... 本研究研发了一种基于重组酶介导核酸扩增(RAA)技术结合胶体金试纸条快速检测牛肠道病毒(BEV)的方法。以高度保守的BEV 5′UTR作为靶序列,设计出特异性引物,下游引物5′端标记生物素,探针5′端标记6-FAM,初步建立RT-RAA方法。将鼠源抗6-FAM单克隆抗体作为金标抗体,链霉亲和素包被于检测线,羊抗鼠IgG包被于质控线,组装试纸条。将RAA技术与制备的胶体金试纸条相结合,建立起检测牛肠道病毒的RT-RAA-LFD方法,并对该方法的特异性、敏感性与重复性及临床应用等方面进行了评价。结果显示,该方法最佳引物浓度为5μmol/L,在35℃反应8 min即可完成对BEV核酸的扩增;该方法最低检测限为10^(1)拷贝/μL,且与牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应;制备的试纸条于4℃条件下,有效期至少为90 d;74份临床样品检测结果显示,该方法与RT-PCR检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的BEV RT-RAA-LFD方法灵敏度高、特异性强,且操作更加便捷,适用于临床现场检测,为BEV感染的诊断和流行病学调查提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 牛肠道病毒 5′UTR rt-raa-LFD 胶体金试纸条

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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立 被引量：1

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作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度

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猫冠状病毒荧光RT-RAA检测方法的建立 被引量：8

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作者 张安洁 张慧 +5 位作者 殷文婷 肖望成 王玥 魏荣 代飞燕 李晓成 《动物医学进展》 北大核心 2021年第6期36-39,共4页

根据猫冠状病毒(FCoV)7b基因序列,设计引物及探针,建立了FCoV荧光RT-RAA检测方法。该方法能够在39℃恒温条件下,20 min内对病原进行快速检测,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为1.97×101 ... 根据猫冠状病毒(FCoV)7b基因序列,设计引物及探针,建立了FCoV荧光RT-RAA检测方法。该方法能够在39℃恒温条件下,20 min内对病原进行快速检测,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为1.97×101 fg/μL。用套式PCR与建立的荧光RT-RAA对30份疑似FCoV感染临床样品进行检测,两种方法符合率为93.33%。结果表明,建立的FCoV荧光RT-RAA方法适用于FCoV快速检测。 展开更多

关键词 猫冠状病毒 荧光rt-raa 快速检测

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猪传染性胃肠炎病毒荧光RT-RAA方法的建立及初步应用 被引量：7

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作者 吕荞 赵钟毅 +10 位作者 尹德玮 刘宇梦 汪伟 郑敏 胡诗悦 赵宸辰 张昕宇 雷晓哓 陆景仪 孙文超 兰添 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期2208-2214,共7页

旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法。本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV荧光逆转录重组酶介异等温... 旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法。本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV荧光逆转录重组酶介异等温扩增(reverse-transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在42℃恒温条件下进行,20 min即可完成检测,与猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒、猪肠道α冠状病毒等猪源病毒均无交叉反应;将TGEV-N稀释后,以10^(0)~10^(6)拷贝·μL^(-1)作为模板,进行敏感性试验,结果表明,该方法最低检出限可以达到6.62×10^(1)拷贝·μL^(-1);采用该方法对50份猪源样品进行检测,阳性率为6%(3/50),检测结果与RT-PCR一致。本试验建立的TGEV荧光RT-RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为TGEV的临床筛查提供可行技术。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 荧光rt-raa 临床检测

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