反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测猪繁殖与呼吸综合征

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作者 于娜 赵爱云 +8 位作者 黄春媛 马佳镁 张紫薇 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 齐萌 曹宗喜 《新疆农业科学》 北大核心 2025年第3期748-753,共6页

【目的】针对PRRSV Nsp2基因建立反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。【方法】设计经典毒株和高致病毒株引物及探针,检测RT-RAA的敏感性及特异性等。【结果】方法与猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV Bartha-K61)、猪... 【目的】针对PRRSV Nsp2基因建立反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。【方法】设计经典毒株和高致病毒株引物及探针,检测RT-RAA的敏感性及特异性等。【结果】方法与猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV Bartha-K61)、猪流行性腹泻病毒(PEDV Purdue)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV LJX)的核酸均无交叉反应;方法对高致病性毒株最低检出限为1.71×10^(1) copies/μL,对经典株最低检出限为2.19×10^(3) copies/μL。高致病毒株方法敏感性为95.5%,特异性为100%;经典株方法敏感性为93.0%,特异性为100%,2种方法具有高度的一致性。【结论】建立的PRRSV RT-RAA荧光法可以区分2种不同的毒株并且特异性良好、灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖于呼吸综合征病毒 rt-raa NSP2基因 特异性 敏感性 高致病毒株 经典毒株

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猪塞内卡病毒RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法的建立及应用

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作者 李晨钰 沙洲 +10 位作者 郑辉 崔进 迟田英 陈峰 曹振山 张慧 戈胜强 魏荣 南福龙 古少鹏 尼博 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第2期195-203,共9页

建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引... 建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引物,筛选最适扩增引物、最佳反应温度、最优RT-RAA反应体系。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR反应体系。利用6种常见猪群病原核酸验证已建立方法特异性。用数字PCR标定的SVA cRNA标准品验证已建立方法敏感性。通过重复试验验证方法的稳定性。应用已建立的方法与临床样品进行符合检验。RT-RAA及CRISPR反应体系优化结果显示,RT-RAA反应温度为37℃,扩增效果最佳;从8条crRNA中筛选出crRNA 5检测信号最强。建立的RT-RAA-CRISPR Cas13a方法特异性好,与ASFV、PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV、PRV等常见猪群疫病均无交叉反应;方法敏感性高,对SVA最低检测限为0.86 copy/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光,重复性好;能够在50 min内完成临床样品检测,对临床检毕的6份阳性样品及58份阴性样品进行符合检测,结果表明检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立了一种高特异性、高敏感性的RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法,有望应用于SVA的现场快速检测。 展开更多

关键词 rt-raa CRISPR/Cas13a SVA

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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法

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作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页

玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多

关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(rt-raa)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条

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马尔堡病毒核酸RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立 被引量：1

4

作者 牛莉娟 张宇欣 +4 位作者 张子莫 曹增国 黄培 张海丽 王化磊 《病毒学报》 北大核心 2025年第5期1478-1487,共10页

马尔堡病毒病(Marburg virus disease,MVD)是由马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)引起的烈性人兽共患传染病,以病毒性出血热为主要特征,病死率高达24%~88%。埃及果蝠是该病毒的自然宿主,而人类及非人灵长类动物则是其主要感染对象。近年来... 马尔堡病毒病(Marburg virus disease,MVD)是由马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)引起的烈性人兽共患传染病,以病毒性出血热为主要特征,病死率高达24%~88%。埃及果蝠是该病毒的自然宿主,而人类及非人灵长类动物则是其主要感染对象。近年来,由于埃及果蝠活动频繁、经济全球化进程加快,MARV外溢风险不断加大。然而,目前全球尚无获批上市的针对MARV的疫苗或特效药物,因此,研发快速精准的MARV检测方法,对全球疫情防控、保障人类健康安全意义重大。本研究将逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)技术与CRISPR/Cas12a分子检测系统相结合,以MARV的NP基因为检测靶标,建立了一种高灵敏度、强特异性且高效便捷的MARV核酸可视化检测方法。结果表明,该方法最低可检测到4.9×10^(-1)copies/μL的MARV重组质粒,且与尼帕病毒RNA、埃博拉病毒RNA等多种病毒不存在交叉反应。本方法为MVD的早期诊断与防控提供了重要技术支撑,在临床诊断、疫情监测及公共卫生安全领域具有较高的应用价值。 展开更多

关键词 马尔堡病毒 核酸可视化检测 rt-raa CRISPR/Cas12a NP基因

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番茄斑驳花叶病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a的可视化检测方法的建立

5

作者 董铮 赵振兴 +3 位作者 范奇璇 王思元 周涛 张永江 《植物病理学报》 北大核心 2025年第3期504-510,共7页

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)是近年来发现的一种新的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒,主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物,严重影响果实的产量和品质。本研究根据ToMMV编码外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶... 番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)是近年来发现的一种新的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒,主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物,严重影响果实的产量和品质。本研究根据ToMMV编码外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因,通过优化反应体系及特异性和灵敏度的验证,建立了ToMMV快速灵敏的可视化检测方法。优化结果显示,当报告基因FQ终浓度为300 nmol·L^(-1)、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)和1000 nmol·L^(-1)条件下检测效果最好,最终RT-RAA和CRISPR/Cas12a显色体系只需分别反应15 min,通过便携式蓝光照射设备可以直接观察到阳性信号。实际样品检测结果显示,本研究建立的检测技术可以在辣椒和番茄中检测到ToMMV。该方法可特异性检测ToMMV,对携带ToMMV样品的RNA检测灵敏度可达2.5 pg·μL^(-1),是RT-PCR检测灵敏度的100倍,可用于ToMMV快速灵敏的可视化检测。 展开更多

关键词 番茄斑驳花叶病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a 可视化检测

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李属坏死环斑病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立与应用

6

作者 张晓琪 沈建国 +4 位作者 廖富荣 李为民 金雨洁 沙依旦·吾甫尔 郑璐平 《中国农业科学》 北大核心 2025年第12期2371-2381,共11页

【目的】利用逆转录重组酶介导的核酸等温扩增技术(reverse transcriptase recombinase-aided amplification,RT-RAA)结合CRISPR/Cas12a系统,建立李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化... 【目的】利用逆转录重组酶介导的核酸等温扩增技术(reverse transcriptase recombinase-aided amplification,RT-RAA)结合CRISPR/Cas12a系统,建立李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。【方法】依据PNRSV外壳蛋白(coat protein,CP)编码基因的保守序列,设计并筛选扩增效率高、特异性强的引物;针对引物和探针的浓度、扩增体系、反应温度和时间等条件进行优化,建立PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。利用该方法对PNRSV、李痘病毒(plum pox virus,PPV)、苹果花叶病毒(apple mosaic virus,ApMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)等李属植物常见病毒进行检测,验证方法的特异性;将PNRSV的总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR、RT-RAA以及RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法进行检测,比较3种方法的灵敏度;对口岸收集的31份疑似感染病毒的桃果实试验样品进行RT-RAA-CRISPR/Cas12a和RT-PCR方法检测,验证该可视化检测方法的实用性。【结果】成功建立了用于检测PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法。最终体系优化结果为引物RT-RAA-PNRSV-F2/R2、荧光报告基因FQ、CRISPR-Cas12a、PNRSV-crRNA(CRISPR RNA,crRNA)的工作浓度分别为0.4μmol·L^(-1)、800、200、240 nmol·L^(-1),反应条件为41℃下反应45 min。该方法可特异性检测PNRSV,与李属植物常见病毒无交叉反应。对携带PNRSV的桃果实样品RNA的检测灵敏度,RT-RAA和RT-RAA-CRISPR/Cas12a分别可达3.06 pg·μL^(-1)和306 fg·μL^(-1),RT-RAA-CRISPR/Cas12a灵敏度是RT-RAA和RT-PCR的10倍。口岸收集的31份桃果实试验样品中,RT-PCR检出14份阳性样品,RT-RAA-CRISPR/Cas12a检出15份阳性样品,两者检测结果一致率基本一致。【结论】建立了PNRSV的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法,该方法具有简便、快速、高灵敏度、高特异性和直观的特点,适用于现场快速检测PNRSV。 展开更多

关键词 李属坏死环斑病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a 可视化检测

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猪捷申病毒荧光RT-RAA检测方法的建立及应用 被引量：1

7

作者 孙志华 林青 +4 位作者 康龙滨 王隆柏 周伦江 俞道进 陈秋勇 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期130-133,共4页

为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 mi... 为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 min即可完成对PTV核酸扩增,最低检出限度为30.1 copies/μL;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)均无交叉反应;重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;23份临床样品检测显示PTV阳性率为21.74%(5/23),检测结果与RT-qPCR一致。说明建立的PTV荧光RT-RAA检测方法具有简便、高效、稳定等优点,为PTV的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多

关键词 猪捷申病毒 荧光逆转录重组酶介导等温扩增 检测方法

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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的猪流行性腹泻病毒检测方法的建立与初步应用 被引量：1

8

作者 郑江涛 刘哲言 +2 位作者 王永富 青易 朱玲 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第4期1034-1042,共9页

【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双... 【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双读数功能的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化平台,并对其检测能力进行了评估。【结果】该方法可特异性检测PEDV,与猪德尔塔冠状病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,且检测灵敏度达到1 copy/µL;与行业标准RT-qPCR方法的检测结果相比,其符合率达到100%。【结论】建立的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化检测方法可在1 h内完成对PEDV的检测,为快速现场诊断和防控提供了有力的技术保障。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 反转录-重组酶介导等温核酸扩增技术 规律间隔成簇短回文重复序列-关联蛋白13a 可视化检测

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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的寨卡病毒检测方法的建立

9

作者 张雅路 石耀强 +3 位作者 刘金胜 李世林 陈利民 杨春晖 《临床输血与检验》 2025年第3期393-401,共9页

目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的新发黄病毒,近期研究提示其可能通过输血途径传播。现有检测方法存在灵敏度不足及覆盖范围有限等问题,亟需开发适用于中小型实验室或现场筛查的便捷检测技术。方法本研究基于CRISPR/Cas... 目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的新发黄病毒,近期研究提示其可能通过输血途径传播。现有检测方法存在灵敏度不足及覆盖范围有限等问题,亟需开发适用于中小型实验室或现场筛查的便捷检测技术。方法本研究基于CRISPR/Cas13a系统联合逆转录重组酶介导链置换核酸扩增(RT-RAA)技术,建立并优化了一种胶体金试纸条检测法,用于ZIKV RNA的特异性识别。结果所构建的RT-RAA-CRISPR/Cas13a试纸条检测灵敏度达4 copies/μL,特异性为100%,可精准检测梯度浓度标准品及临床样本。对ZIKV阳性样本的检测符合率为100%,阴性符合率亦为100%。血浆样本检测的灵敏度、特异性、阳性预测一致性(positive predictive agreement,PPA)和阴性预测一致性(negative predictive agreement,NPA)均为100%。结论本研究成功开发了一种基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a技术的ZIKV快速可视化检测试纸条。该方法操作简便、灵敏度高、结果判读直观,为寨卡感染的现场筛查提供了可替代PCR检测的新型解决方案,特别适用于资源有限场景下的即时诊断需求。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas13a 逆转录重组酶介导链置换核酸扩增 寨卡病毒 即时检测

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猪流行性腹泻病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

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作者 仇德洋 王海燕 +3 位作者 郑佳 杜建才 陈昭 李桂梅 《中国动物检疫》 2025年第7期90-95,共6页

为开发一种可靠、简易、便捷的现场猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,基于反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,建立了用于现场检测PEDV的RT-RAA-LFD方法。根据PEDV N基因保守序列进行引物和探针设计,通过试验优选... 为开发一种可靠、简易、便捷的现场猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,基于反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,建立了用于现场检测PEDV的RT-RAA-LFD方法。根据PEDV N基因保守序列进行引物和探针设计,通过试验优选出一套引物及一条探针,同时对RT-RAA反应时间和温度条件进行优化。优化后的方法在37℃恒温反应15 min,即可实现对PEDV目的基因片段的有效扩增;与其他常见腹泻病毒无交叉反应,最低检测限为1.23×10^(1) copies/μL;对134份临床样品进行检测,阳性检出率为5.97%,与国标检测方法结果一致。结果表明,本研究建立的PEDV RT-RAA-LFD检测方法操作简便,结果特异、灵敏,不需要专业的实验室设备和实验人员,适用于在资源有限地区对PEDV的检测,能够满足基层临床工作人员的需求。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶介导等温扩增 侧向层析试纸条

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裂谷热病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a核酸可视化检测方法的建立

11

作者 牛莉娟 黄培 +5 位作者 靳凯凯 张子莫 武晓瑄 李媛媛 王化磊 张海丽 《实验动物科学》 2025年第5期34-42,共9页

目的针对裂谷热病毒(RVFV),建立快速可视化检测方法,为RVFV早期诊断、实验动物健康监测及疫情防控提供技术支持。方法分析RVFV S基因保守序列,设计并筛选特异性反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)引物与CRISPR/Cas12a系统的gRNA,建立RT-R... 目的针对裂谷热病毒(RVFV),建立快速可视化检测方法,为RVFV早期诊断、实验动物健康监测及疫情防控提供技术支持。方法分析RVFV S基因保守序列,设计并筛选特异性反转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)引物与CRISPR/Cas12a系统的gRNA,建立RT-RAA-CRISPR/Cas12a核酸可视化检测方法;优化CRISPR/Cas12a反应体系,每个浓度设置3个平行,随后优化RT-RAA反应条件,以提高方法的检测性能;随后评价该方法的敏感性及特异性。所有实验结果均经3次重复实验验证。结果针对RVFV S基因,建立了RT-RAA-CRISPR/Cas12a核酸可视化检测方法;通过条件优化实验确定,当Cas12a蛋白工作浓度为0.053μmol/L、gRNA工作浓度为0.075μmol/L,在39℃条件下完成30 min等温扩增、随后于37℃进行20 min检测反应时,该方法的检测性能最佳;敏感性实验结果显示,该方法可稳定检出浓度低至0.5 copies/μL的RVFV S基因重组质粒,具有高敏感性;特异性实验表明,该方法与尼帕病毒RNA、拉沙病毒重组质粒(N基因)、埃博拉病毒RNA、新布尼亚病毒RNA无交叉反应,具有强特异性。结论本研究成功建立了RVFV RT-RAA-CRISPR/Cas12a核酸可视化检测方法,该方法具有敏感性高、操作简单等优势,有望应用于基层实验室,为RVFV早期检测提供技术支持,助力疫苗研发及疫情防控。 展开更多

关键词 裂谷热病毒 反转录重组酶介导等温扩增 CRISPR/Cas12a 核酸可视化检测

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猫冠状病毒荧光RT-RAA检测方法的建立 被引量：8

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作者 张安洁 张慧 +5 位作者 殷文婷 肖望成 王玥 魏荣 代飞燕 李晓成 《动物医学进展》 北大核心 2021年第6期36-39,共4页

根据猫冠状病毒(FCoV)7b基因序列,设计引物及探针,建立了FCoV荧光RT-RAA检测方法。该方法能够在39℃恒温条件下,20 min内对病原进行快速检测,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为1.97×101 ... 根据猫冠状病毒(FCoV)7b基因序列,设计引物及探针,建立了FCoV荧光RT-RAA检测方法。该方法能够在39℃恒温条件下,20 min内对病原进行快速检测,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为1.97×101 fg/μL。用套式PCR与建立的荧光RT-RAA对30份疑似FCoV感染临床样品进行检测,两种方法符合率为93.33%。结果表明,建立的FCoV荧光RT-RAA方法适用于FCoV快速检测。 展开更多

关键词 猫冠状病毒 荧光rt-raa 快速检测

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猪传染性胃肠炎病毒荧光RT-RAA方法的建立及初步应用 被引量：7

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作者 吕荞 赵钟毅 +10 位作者 尹德玮 刘宇梦 汪伟 郑敏 胡诗悦 赵宸辰 张昕宇 雷晓哓 陆景仪 孙文超 兰添 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期2208-2214,共7页

旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法。本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV荧光逆转录重组酶介异等温... 旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法。本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV荧光逆转录重组酶介异等温扩增(reverse-transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在42℃恒温条件下进行,20 min即可完成检测,与猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒、猪肠道α冠状病毒等猪源病毒均无交叉反应;将TGEV-N稀释后,以10^(0)~10^(6)拷贝·μL^(-1)作为模板,进行敏感性试验,结果表明,该方法最低检出限可以达到6.62×10^(1)拷贝·μL^(-1);采用该方法对50份猪源样品进行检测,阳性率为6%(3/50),检测结果与RT-PCR一致。本试验建立的TGEV荧光RT-RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为TGEV的临床筛查提供可行技术。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 荧光rt-raa 临床检测

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猪德尔塔冠状病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用 被引量：3

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作者 赵平 秦毅斌 +7 位作者 何颖 卢冰霞 刘芳 陈樱 韦祖樟 黄伟坚 赵武 欧阳康 《中国动物检疫》 CAS 2021年第8期85-89,共5页

近年来,猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)给养猪业造成了较大经济损失。为快速检测PDCoV,针对病毒N基因设计特异引物,建立了PDCoV重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RT-RAA)。通过优化引物浓度、反应温度,确定了最佳反应条... 近年来,猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)给养猪业造成了较大经济损失。为快速检测PDCoV,针对病毒N基因设计特异引物,建立了PDCoV重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RT-RAA)。通过优化引物浓度、反应温度,确定了最佳反应条件,然后进行了特异性和灵敏性试验,并与普通RT-PCR方法进行了比较。结果显示:该方法特异性较好,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪捷申病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等猪源病毒无明显交叉反应;反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30 min即可得到扩增结果;反应体系可检测的最低扩增拷贝数为10 copies/μL,敏感性较高;该方法检测68份猪源病毒样品的PDCoV阳性检出率为17.6%,高于普通RTPCR(13.2%)。结果表明,本研究建立的RT-RAA快速检测PDCoV方法具有快速、特异、灵敏的优点,可用于PDCoV的快速检测和流行病学监测。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 rt-raa 快速检测

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猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用 被引量：2

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作者 王恋春 郑辉 +7 位作者 张慧 沙洲 房琳琳 尼博 董雅琴 魏荣 崔进 郑泽中 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第20期63-68,74,共7页

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-tran... 为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 N基因 猪流行性腹泻 实时荧光rt-raa 检测方法

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鸭星状病毒3型RT-RAA快速检测方法的建立 被引量：3

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作者 邓春冉 张富友 +8 位作者 尚佳静 罗娟 于晓慧 蒋文明 刘华雷 王一新 刘冠慧 徐丽娜 李阳 《中国动物检疫》 CAS 2022年第11期105-110,共6页

鸭星状病毒是近年来危害我国鸭业发展的新发病原之一,给养鸭业造成了较大的经济损失,其中鸭星状病毒3型(DAstV-3)是近年来感染率较高的星状病毒。为实现DAstV-3的快速检测,根据DAstV-3的RNA依赖性核糖核酸聚合酶基因(RNA-dependent RNA ... 鸭星状病毒是近年来危害我国鸭业发展的新发病原之一,给养鸭业造成了较大的经济损失,其中鸭星状病毒3型(DAstV-3)是近年来感染率较高的星状病毒。为实现DAstV-3的快速检测,根据DAstV-3的RNA依赖性核糖核酸聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)设计特异性探针与引物,建立了DAstV-3的荧光RT-RAA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性和临床适用性进行了评估。结果显示:建立的RT-RAA方法能够在39℃恒温条件下,在20 min内实现对DAstV-3的快速检测,与H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、禽呼肠孤病毒等常见病毒均无交叉反应,最低检测限为10~1 copies/μL;临床样本检测发现RT-RAA方法阳性检出率高于常规RT-PCR方法,且检测时间较RT-PCR更短。结果表明,本研究建立的RT-RAA方法灵敏度高,特异性强,操作简便,临床适用性好,适合DAstV-3的现场快速检测。 展开更多

关键词 鸭星状病毒3型 rt-raa 快速检测

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猪流行性腹泻病毒荧光RT-RAA检测方法的建立及初步应用 被引量：1

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作者 侯恩慧 陈秋勇 +6 位作者 吴学敏 丘镜莉 吴仁杰 周伦江 刘玉涛 马玉芳 王隆柏 《福建农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期1146-1151,共6页

【目的】建立一种快捷、灵敏、简便检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的RT-RAA检测方法,以提高猪流行性腹泻病毒临床检测效率。【方法】针对PEDV S基因片段保守区设计引物和探针,构建标准质粒PEDV-S,通过特... 【目的】建立一种快捷、灵敏、简便检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的RT-RAA检测方法,以提高猪流行性腹泻病毒临床检测效率。【方法】针对PEDV S基因片段保守区设计引物和探针,构建标准质粒PEDV-S,通过特异性、敏感性、重复性测定及条件优化,建立检测PEDV重组酶介导链置换核酸扩增荧光法(RT-RAA)。【结果】在42℃恒温作用20 min的条件下,建立的检测方法对检测猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)等猪源病毒均为阴性,猪流行性腹泻病毒(PEDV)为阳性;最低检出限为4.43×10^(2)拷贝·μL^(-1)的标准质粒;重复性结果显示,相同浓度标准质粒的差异性很小;利用建立的RT-RAA方法检测40份猪病毒样本,阳性率为7.5%(3/40),与实时荧光定量PCR检测结果相同。【结论】本研究建立的PEDV RT-RAA检测方法具有快速简便、耗时短、特异性高、灵敏度强和重复性好等特点,适用于对PEDV的快速诊断。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 rt-raa

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小反刍兽疫病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法的建立 被引量：6

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作者 黄超华 阮周曦 +4 位作者 路平 吴江 曹琛福 林彦星 花群义 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期2030-2034,共5页

为建立小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)可视化快速检测方法,本研究根据PPRV N基因的保守序列设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导恒温扩增(RT-RAA)特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA。结合侧向流试纸,... 为建立小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)可视化快速检测方法,本研究根据PPRV N基因的保守序列设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导恒温扩增(RT-RAA)特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA。结合侧向流试纸,本研究建立了一种PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法,并对该方法的性能进行了评估。结果显示,该方法特异性良好,与蓝舌病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、羊痘病毒(CaPV)、猪水泡病病毒(SVDV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒核酸无交叉反应;敏感性高,最低可检出4.30×10^(1)拷贝/μL的PPRV核酸;应用该方法及国家标准推荐的RT-qPCR方法对60个模拟样品进行平行检测,结果显示Kappa值为0.918,表明两者具有高度一致性。综上表明,本研究建立的PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法特异性好、敏感性高,且操作简单、无需特殊仪器,可应用于野外或基层农场的PPRV快速筛查检测工作。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 rt-raa CRISPR/Cas12a

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新型冠状病毒核酸荧光型RT-RAA检测方法的建立及其评价 被引量：4

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作者 高越 刘伯玉 +7 位作者 任翠平 高勇 朱禹 杨莉 温萌 钱振 芦宝静 柳燕 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第6期980-985,共6页

目的建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)荧光型RT-RAA快速检测方法。方法以体外转录SARS-CoV-2的RNA为模板,利用单链DNA结合蛋白、重组酶和DNA聚合酶,在40.5℃恒温下,快速完成orf1ab基因和S基因序列片段的扩增,并用已知新冠核酸阳性和其他呼... 目的建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)荧光型RT-RAA快速检测方法。方法以体外转录SARS-CoV-2的RNA为模板,利用单链DNA结合蛋白、重组酶和DNA聚合酶,在40.5℃恒温下,快速完成orf1ab基因和S基因序列片段的扩增,并用已知新冠核酸阳性和其他呼吸道病毒感染患者咽拭子标本进行初步评价。结果该研究建立的方法分别检测SARS-CoV-2两种基因的所需时长均在20 min以内,检测2种基因的灵敏度均为2拷贝数/反应管,特异性为100%,2种引物的最低检出限3次重复实验扩增反应起峰时间一致,曲线形态接近。结论该研究建立的方法灵敏性高,特异性强,重复性良好,临床标本检测结果符合率高,且不需要昂贵的仪器,适用于现场快速检测。 展开更多

关键词 SARS-CoV-2 rt-raa 核酸 快速检测

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