基于烟草属特异性基因Ntsp051的RPA-LFD检测方法的建立及应用

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作者 张轲 龙杰 +7 位作者 董杏梅 徐世斌 范昱明 普麒 万岳莹 李昌威 林金水 童治军 《西南农业学报》 北大核心 2025年第9期1914-1923,共10页

【目的】探索高效、快速、简便的类烟产品现场鉴别检验方法,增强烟草专卖执法的科学性和时效性。【方法】以烟草属特异性基因Nstp051为检测靶标,设计特异性引物与探针,优化反应的时间和温度,建立基于重组酶聚合酶扩增技术结合横向流动... 【目的】探索高效、快速、简便的类烟产品现场鉴别检验方法,增强烟草专卖执法的科学性和时效性。【方法】以烟草属特异性基因Nstp051为检测靶标,设计特异性引物与探针,优化反应的时间和温度,建立基于重组酶聚合酶扩增技术结合横向流动试纸条(RPA-LFD)的类烟产品中植物源烟草成分的鉴别检验方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行测试。【结果】建立的RPA-LFD检测方法对植物源烟草成分具有特异性,在42℃下反应20 min效果最好,对Ntsp051重组质粒的最低检测限为1.0×10^(2)copies/μL,对K326基因组DNA的最低检测限为50 pg/μL。该方法对不同的植物源烟草成分的灵敏度不同,当烟草与非烟混合基因组DNA浓度为10 ng/μL时,能从混合基因组DNA中检测出最低添加比例为0.5%的烟草基因组DNA。在模拟类烟产品添加试验中,最低可以检测到烟草与非烟草混合材料中添加比例仅为0.05%的植物源烟草成分。【结论】RPA-LFD检测方法简单快速,特异性好,灵敏度高,结果可肉眼判读,可用于类烟产品中植物源烟草成分的快速检测。 展开更多

关键词 类烟产品 Nstp051 重组酶聚合酶扩增技术(RPA) 快速检测 横向流动试纸条(LFD)

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羊痘病毒与羊口疮病毒双重RPA-LFD检测方法的建立与应用 被引量：2

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作者 王玲玲 马爱红 +5 位作者 宋前进 王小龙 曹晓真 刘治凤 陈亚飞 李继东 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期103-111,共9页

【目的】旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测... 【目的】旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测方法。【方法】选取CaPV P32基因及ORFV 011基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV RPA引物各3对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各1条;进行单重基础RPA引物筛选试验;对双重RPA-LFD的反应时间及反应温度进行优化;探索双重RPA-LFD最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重RPA-LFD灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的55份临床样品进行检测。【结果】引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为39℃、反应时间为11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的最佳引物配比为0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为0.1 μL∶0.9 μL;双重RPA-LFD灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×10~0 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示RPA-LFD检测阳性率与PCR检测阳性率相符合。【结论】成功建立了CaPV与ORFV双重RPA-LFD快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断。 展开更多

关键词 羊痘病毒 羊口疮病毒 rpa-lfd 鉴别诊断 混合感染

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空肠弯曲菌RPA-LFD快速检测方法的建立及评价 被引量：1

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作者 叶景芬 武绍碧 +4 位作者 陈世雄 龙宥茨 廖怡雯 罗雪 杨琦 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期2579-2584,共6页

为建立特异、快速、便捷的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)检测方法,以空肠弯曲菌的hip0基因为靶标,设计了1组特异性引物及1条探针,下游引物和探针的5′端分别标记生物素、荧光素,通过对反应时间及温度的优化,建立了C.jejuni... 为建立特异、快速、便捷的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)检测方法,以空肠弯曲菌的hip0基因为靶标,设计了1组特异性引物及1条探针,下游引物和探针的5′端分别标记生物素、荧光素,通过对反应时间及温度的优化,建立了C.jejuni-RPA-LFD检测方法,并对其进行了灵敏度评估及模拟样本检测。结果显示,C.jejuni-RPA-LFD与肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、假单胞菌、蜡样芽胞杆菌、巴氏杆菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门菌无交叉反应,最佳反应体系为37℃、25min,其灵敏度可达3.93×10^(0)拷贝/μL,模拟检测中,可检测出1×10^(2) CFU/mL的空肠弯曲菌污染粪便样本。结果表明,建立的C.jejuni-RPA-LFD具有特异性好、简便、快速、灵敏度高等优点,为畜禽养殖业基层现场、快速诊断空肠弯曲菌及控制其传播提供有效途径。 展开更多

关键词 空肠弯曲菌 rpa-lfd hipO基因

原文传递

H1亚型禽流感病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用 被引量：3

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作者 曾婷婷 李孟 +9 位作者 谢芝勋 李丹 谢丽基 罗思思 张民秀 王盛 谢志勤 范晴 阮志华 粟永春 《江西农业学报》 CAS 2024年第3期61-66,共6页

以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间... 以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间,利用侧向流动免疫(LFD)试纸条观测反应后的结果,最终建立检测H1亚型AIV的RT-RPA-LFD快速检测方法。结果表明:建立的RT-RPA-LFD快速检测方法在探针工作浓度为0.14 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(2)copies/反应的H1亚型AIV RNA,其他常见家禽病原体未见阳性反应。该方法与RT-PCR及鸡胚分离鉴定测序结果完全一致,可满足H1亚型AIV临床快速鉴别诊断的需求,为基层兽医现场快速检测提供技术支撑。 展开更多

关键词 H1亚型AIV 等温扩增技术 快速检测 RT-rpa-lfd

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甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用 被引量：1

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作者 王永江 乔奇 +4 位作者 王爽 赵付枚 田雨婷 张德胜 张振臣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期2781-2790,共10页

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV... 【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。 展开更多

关键词 甘薯褪绿矮化病毒西非株系 逆转录酶重组酶聚合酶扩增 侧向流层析 快速检测 甘薯

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鳗鲡疱疹病毒基础RPA及RPA-LFD检测方法的比较 被引量：3

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作者 林而舒 《渔业研究》 2024年第4期367-374,共8页

【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意... 【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意义。【方法】本研究根据AngHV ORF55设计了扩增引物和探针,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的基础RPA及RPA侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)检测方法,探究了不同时间和温度对基础RPA和RPA-LFD扩增效果的影响,并比较了2种方法的灵敏度、特异性和临床应用效果。【结果】本研究建立的AngHV基础RPA及RPA-LFD快速检测方法扩增产物大小为394 bp;2种检测方法都仅需20~40 min即可完成检测过程;温度的变化对检测方法的影响不大,37~43℃范围内均能得到较好的扩增效果;2种检测方法均与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)无交叉反应,表现出良好的特异性;RPA-LFD检测方法具有更高的检测灵敏度,检出限至1.32×10^(0)copies/mL,基础RPA检出限至1.32×10^(3)copies/mL;检测实验室保存的20份鳗鲡病料DNA,2种方法检测的结果一致,阳性率均为30%,表明AngHV基础RPA和RPALFD检测方法均具有良好的临床应用潜力。【结论】AngHV基础RPA和RPA-LFD检测方法十分适用于基层科研单位、鳗鲡产品加工场及养殖场的病毒检测,丰富了AngHV检测手段的可选性。 展开更多

关键词 鳗鲡 鳗鲡疱疹病毒(AngHV) 重组酶聚合酶等温扩增(RPA) 重组酶聚合酶等温扩增-侧向流层析试纸条法(rpa-lfd)

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RPA-LFD技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的应用 被引量：4

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作者 鲁瑶 赵丽丽 +5 位作者 李马超 刘海灿 赵秀芹 刘志广 万康林 楼永良 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期387-391,共5页

目的基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值。方法采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测。建立RPA-LFD技术,检测... 目的基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值。方法采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测。建立RPA-LFD技术,检测182株菌株中利福平耐药决定区(RRDR)常见突变位点rpoB 531、526和516的突变情况,同时使用PCR测序进行验证。用SPSS 24.0分析,以比例法为金标准,评价RPA-LFD对利福平耐药的检测效率。结果以比例法药敏结果为金标准,RPA-LFD检测利福平耐药的灵敏度为84.2%,特异度为100.0%,Kappa检验显示Kappa值为0.880,两种方法检测结果具有高度一致性。同样以比例法为金标准,以DNA测序结果判断利福平耐药性的灵敏度为91.2%,特异度为100.0%,Kappa值为0.935。结论RPA-LFD技术用于结核分枝杆菌利福平耐药性的检测具有好的灵敏度、很高的特异度,且检测时间短,具有一定的临床应用价值。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 利福平耐药 rpa-lfd RRDR 突变

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多重RPA-LFD技术快速检测磺胺类耐药基因研究 被引量：5

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作者 马骉 郑超 +4 位作者 黄丽芬 李安源 王家敏 毛崇辉 张明洲 《中国计量大学学报》 2019年第3期317-322,366,共7页

目的:畜禽养殖业普遍存在抗生素过量使用甚至滥用的现象,导致动物源细菌耐药性问题越来越严重。磺胺类药物是应用最广泛的抗生素之一,对磺胺类耐药基因进行快速检测,有利于控制动物源耐药细菌的传播。方法:利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA... 目的:畜禽养殖业普遍存在抗生素过量使用甚至滥用的现象,导致动物源细菌耐药性问题越来越严重。磺胺类药物是应用最广泛的抗生素之一,对磺胺类耐药基因进行快速检测,有利于控制动物源耐药细菌的传播。方法:利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)在常温下快速扩增痕量核酸的特点,结合横向流动试纸条(LFD),对动物源大肠杆菌磺胺耐药基因 sul1,sul2和sul3进行同步快速检测,以实现现场可视化快速检测。结果:磺胺耐药基因sul1、sul2、sul3 在动物源大肠杆菌中的检出率分别为36.36%(84/231)、54.54%(126/231)和68.39%(158/231),检测限可达到10 3copies/μL,且无交叉反应。结论:此方法结果简单易读,可为磺胺类耐药基因现场可视化快速检测提供技术支撑。 展开更多

关键词 计量 多重rpa-lfd 快速检测 动物源大肠杆菌 磺胺类耐药基因

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猪嵴病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)快速诊断方法的建立与应用 被引量：5

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作者 蔡应奎 刘新生 +2 位作者 张丽萍 周鹏 王永录 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期820-824,共5页

自2007年在猪粪便中首次检测到猪嵴病毒(PKV)以来,该病毒已在世界范围内被广泛报道,并可能与仔猪的腹泻有关。本研究首次建立了以重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的技术来检测PKV的快速、可视化的诊断方法,并对此方法的敏... 自2007年在猪粪便中首次检测到猪嵴病毒(PKV)以来,该病毒已在世界范围内被广泛报道,并可能与仔猪的腹泻有关。本研究首次建立了以重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的技术来检测PKV的快速、可视化的诊断方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,该方法具有良好的特异性,仅可以特异性扩增PKV,与其它主要猪病毒没有交叉反应;最佳反应时间和温度是RPA在37℃下20 min及LFD在室温下10 min;检测极限为1×10~2拷贝的PKV。利用本研究建立的RPA-LFD方法和常规RT-PCR方法同时检测20份猪的临床粪便样品,结果显示,RPA-LFD方法检测猪嵴病毒阳性率为60%,明显高于常规RT-PCR的50%。上述结果表明,RPA-LFD方法可应用于猪嵴病毒的快速检测。 展开更多

关键词 猪嵴病毒 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析(LFD) 快速诊断方法

原文传递

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发 被引量：7

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作者 华俊 曾婷婷 +7 位作者 谢芝勋 谢丽基 李孟 罗思思 王盛 万丽军 任红玉 谢志勤 《中国动物检疫》 CAS 2023年第4期99-105,共7页

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试... 禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物,使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系,优化探针浓度和反应温度,使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验,最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示,建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(1)copies/反应的ARV RNA,并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料,发现有3份ARV阳性,与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的ARV RT-RPA-LFD检测方法,具有快速、特异,不需要大型复杂仪器,可直观观测结果的优势,为基层兽医实验室和兽医现场检测提供了技术参考。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒 重组聚合酶核酸等温扩增技术 侧向流动免疫试纸条

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布鲁氏菌RPA-LFD快速检测方法的建立与应用 被引量：18

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作者 张珊珊 李楠 +2 位作者 郝镯 孟轲音 刘军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1215-1220,共6页

为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断布病的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与胶体金侧向流试纸条技术(lateral flow dipstick,LFD)相结合。根据布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区设计1套标有生物素... 为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断布病的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与胶体金侧向流试纸条技术(lateral flow dipstick,LFD)相结合。根据布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区设计1套标有生物素Biotin的特异性引物和1条标记dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,通过对反应条件、体系的优化,以及对敏感性、特异性以及模拟样本的分析,最后进行临床应用,建立一种可以检测布鲁氏菌的RPA-LFD方法。结果显示,成功建立了布鲁氏菌RPA-LFD检测方法,最佳反应条件为闭合手掌中孵育12 min;引物与探针的最佳比为3.5∶1;RPA-LFD方法的最低检测限为5.89 CFU/m L,能够特异地检测出布鲁氏菌,检测大肠杆菌等其他细菌结果均为阴性;用RPA-LFD方法检测模拟样本和临床样品的结果与ELISA方法一致。上述结果表明,本研究建立的布鲁氏菌RPA-LFD检测方法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于临床检测。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 横向流动试纸条 bcsp31基因 重组酶聚合酶扩增 模拟样本

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葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系的建立 被引量：3

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作者 黄强 张强强 顾沛雯 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第4期89-97,共9页

【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜... 【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计了PF1/PR1、PF2/PR2和PF3/PR3共3对引物及探针RPA-P,对葡萄霜霉病菌DNA的ITS序列进行PCR扩增,建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,并对其反应条件进行优化,对其特异性和灵敏性进行检测。【结果】建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,引物PF1/PR1和探针RPA-P对靶标片段具有良好的特异性,检测条件为36℃扩增30 min,对葡萄霜霉病菌具有特异性;最低检测下限为10 pg/μL,灵敏性略低于常规PCR(1 pg/μL)和荧光定量PCR(100 fg/μL);对田间发病叶片的检测结果与常规PCR一致,准确性高。【结论】建立的葡萄霜霉病菌重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测体系,可以对目标物质进行快速、可视化检测,具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适宜推广使用。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 葡萄生单轴霉 重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测 病原检测

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黄颡鱼实时荧光RPA及侧向流RPA试纸条快速现场鉴定方法的建立与应用

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作者 林玉 张旻 +11 位作者 王娜 何舜平 张辉 唐永凯 方成池 景宏丽 张浪 沙航 段志强 王宽 吕继洲 吴绍强 《水生生物学报》 北大核心 2025年第4期120-128,共9页

研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,... 研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析,针对COI基因保守区域,设计了特异性探针和引物。测试结果显示,在37℃条件下,实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测,且最低检测限可以达到102拷贝数/反应;而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷,能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测,两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此,研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法,拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势,具有良好的现场快速检测应用前景。此外,其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题,检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期,为水产品监管执法提供技术手段。 展开更多

关键词 快速物种鉴定 重组酶聚合酶扩增 实时荧光型RPA 侧向流RPA试纸条 黄颡鱼

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梨火疫病菌的RPA快速检测技术的研发 被引量：5

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作者 蒲姝旸 张瑾逸 +4 位作者 暴晓阳 孟青青 田茜 蔡璐璐 赵文军 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期242-249,282,共9页

梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全... 梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全球防控梨火疫病菌扩散危害的重要方法之一,目前我国植物检疫部门主要从实验室分离鉴定、分子检测和田间症状识别及快速检测方面开展工作。本研究基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术和E.amylovora 16S-23S ITS区间的保守序列设计的引物和探针,建立了实时荧光RPA和侧流层析试纸条RPA两种检测方法。经测试,在39℃条件下,这两种检测方法都具有良好的特异性,分别能在20 min和10 min内完成扩增。实时荧光RPA对E.amylovora菌株DNA的检测阈值为1.38×10^(-2)ng/μL;侧流层析试纸条RPA对E.amylovora菌悬液和DNA的检测阈值分别为10^(4)cfu/mL和1.38×10^(-3)ng/μL。侧流层析试纸条RPA体系因反应快速、读取结果方便、不需要复杂仪器操作可以满足现场快速检测的需求。 展开更多

关键词 梨火疫病 快速检测 重组酶聚合酶扩增(RPA) 实时荧光型RPA 侧流层析试纸条型RPA

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果生刺盘孢菌LFD-RPA可视化快速检测方法的建立

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作者 潘锐 徐会永 +4 位作者 臧昊昱 谷春艳 齐永杰 杨雪 高正辉 《安徽农业科学》 CAS 2024年第23期136-139,共4页

建立针对果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)的快速、准确、简便的检测方法。根据果生刺盘孢菌的基因序列设计了特异性检测引物和探针,建立了重组酶聚合酶扩增与侧流层析试纸条(LFD-RPA)相结合的可视化快速检测果生刺盘孢菌的方... 建立针对果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)的快速、准确、简便的检测方法。根据果生刺盘孢菌的基因序列设计了特异性检测引物和探针,建立了重组酶聚合酶扩增与侧流层析试纸条(LFD-RPA)相结合的可视化快速检测果生刺盘孢菌的方法。该检测方法与其他病原菌无交叉反应,特异性强,且检测灵敏度达1 pg/μL。该检测方法无需PCR仪等复杂设备,在39℃恒温反应12 min即可完成检测过程,为果生刺盘孢菌的检验检测和早期预警提供了技术支撑。 展开更多

关键词 果生刺盘孢菌 LFD-RPA 可视化快速检测

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2种核酸快提取法对羊口疮病毒和羊痘病毒DNA提取效能的比对研究

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作者 谭小雨 杨洋 +2 位作者 郭紫晶 李彦敏 张志东 《畜禽业》 2023年第5期1-5,9,共6页

目的合理选择病毒快速核酸提取方法。方法分别采用2种商品化核酸快提取法——Cell-to-cDNA裂解液(A法)和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A,B法),提取羊临床样品中的羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(CaPV)核酸,使用实时荧光定... 目的合理选择病毒快速核酸提取方法。方法分别采用2种商品化核酸快提取法——Cell-to-cDNA裂解液(A法)和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A,B法),提取羊临床样品中的羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(CaPV)核酸,使用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)和重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)方法进行平行检测,并与常规核酸提取方法(宝生物病毒DNA/RNA提取试剂盒,C法)比较。结果与C法相比,在A法和B法提取的46份疑似orf拭子中,qPCR的ORFV核酸检出率分别为70.8%和87.5%,RPA-LFD的检出率分别为69.5%和82.6%;在A法和B法提取的52份疑似CaP的拭子样品中,qPCR的CaPV核酸检出率分别为77%和90%,RPA-LFD的检出率分别为65.5%和89.7%。对组织样品分析发现:A法不能用于组织样品的核酸提取;在B法提取的52份疑似orf组织样品核酸中,与C法相比,qPCR的ORFV核酸检出率为93.7%,RPA-LFD的检出率93.3%;对B法提取的61份疑似CaP组织样品核酸中,qPCR的CaPV核酸检出率为94.5%,RPA-LFD的检出率为88.7%。结论磁珠核酸提取方法(B法)可适用于不同样品中的ORFV和CaPV核酸的快速提取。 展开更多

关键词 快速核酸提取试剂 羊口疮 羊痘 qPCR rpa-lfd

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猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用 被引量：9

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作者 张森豪 王雪莹 +12 位作者 蔡李萌 解伟纯 匡虹迪 王晓娜 李佳璇 崔文 姜艳平 周晗 单智夫 王丽 乔薪瑗 李一经 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2498-2508,共11页

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶... 旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析(LFD) 快速诊断方法

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猫疱疹病毒1型RPA-Cas12a-LFD检测方法的建立及初步应用 被引量：5

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作者 黄坚 刘韵佳 +1 位作者 杨晓农 李妍 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1638-1643,共6页

猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1,FHV-1)为水痘病毒属的双链DNA包膜病毒,是引起猫上呼吸道感染的主要病原之一。本研究以重组聚合酶扩增(RPA)、Cas12a反式酶切反应和侧流层析试纸条(LFD)显示技术为基础,旨在建立靶向FHV-1 TK基因的R... 猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1,FHV-1)为水痘病毒属的双链DNA包膜病毒,是引起猫上呼吸道感染的主要病原之一。本研究以重组聚合酶扩增(RPA)、Cas12a反式酶切反应和侧流层析试纸条(LFD)显示技术为基础,旨在建立靶向FHV-1 TK基因的RPA-Cas12a-LFD快速可视化检测方法。根据FHV-1 TK基因的保守片段序列设计RPA引物和合成crRNA的引物,并通过反应体系验证、RPA-Cas12a-LFD检测灵敏度和特异性分析,以及临床样本的符合检测,评价FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法的有效性。结果显示,建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法可以特异性地检出FHV-1(与其他猫相关病原无交叉反应),灵敏度极高(最低检测限为2.35×10^(-1) copies·μL^(-1)),检测时间短,结果可视化。该方法对20份表现明显症状的患猫呼吸道样本的FHV-1检出率(35%,7/20)高于现有的TB Green qPCR方法(25%,5/20),对其中5份阳性样本的检测符合率为100%。综上表明,成功建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD检测方法的特异性好和敏感性极高,不需要特殊的检测设备,可以作为FHV-1现场快速检测的有效工具。 展开更多

关键词 猫疱疹病毒1型 RPA-Cas12a-LFD 核酸检测 应用

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烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立 被引量：3

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作者 黎妍妍 邱梦娟 +7 位作者 李锡宏 张艺千 徐婷婷 许汝冰 马畔 郑露 李伦安 黄俊斌 《中国烟草科学》 CSCD 北大核心 2023年第5期62-69,共8页

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增... 烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。 展开更多

关键词 烟草靶斑病 立枯丝核菌 重组酶聚合酶扩增技术 侧流层析试纸条

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李矮缩病毒重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条检测方法的建立 被引量：6

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作者 陈玲 闫国华 +5 位作者 张晓明 周宇 王晶 段续伟 李彦林 张开春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期183-192,共10页

根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。... 根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。该方法在恒温39℃下反应20 min,具有标记的扩增子可达到检测水平。扩增子检测室(amplicon detection champer)中的侧流层析试纸条在20 min内呈现可视化检测结果。该方法与侵染樱桃的另外6种病毒(CGRMV、PNRSV、Lch V-1、PBNSPa V、CVA和CNRMV)无交叉反应。灵敏度试验表明,用RPA-LFD方法检测PDV的灵敏性是PCR方法的10倍。用该方法检测13个田间样品,其检测结果与PCR检测结果一致。RPA-LFD法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等特点,适合对PDV样品的快速检测与鉴定。 展开更多

关键词 李矮缩病毒 樱桃 重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条 检测

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