弓形虫MIC1、MIC6和ROP18混合蛋白对小鼠的免疫保护作用

1

作者 李虎 朱进进 +2 位作者 李婧旸 韩成建 余莉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第3期34-41,共8页

为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血... 为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血清特异性抗体,以及免疫蛋白刺激后脾细胞培养上清中各细胞因子的水平,通过脾淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞增殖情况。最后一次免疫后,用弓形虫WH3强毒株攻击,观察并记录小鼠的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,蛋白免疫组产生高滴度的IgG和IgG亚型(IgG1和IgG2a)抗体,滴度可高达1∶128000。细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平不同程度地升高,并且重组蛋白能够诱导淋巴细胞特异性增殖。免疫组小鼠的生存时间较对照组有所延长,其中MIC6-ROP18组延长时间最长(P<0.01)。MIC1、MIC6和ROP18组成的重组疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,其中MIC6-ROP18蛋白组合的免疫保护效果更为明显,但仍需进一步改进。本研究为弓形虫疫苗的研发提供了思路。 展开更多

关键词 弓形虫疫苗 重组蛋白 MIC1 MIC6 rop18

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刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析 被引量：21

2

作者 郭玲玲 张晓磊 +5 位作者 张进顺 贾晓晖 姜文静 王春苗 刘楠 朱晓波 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第5期414-419,共6页

目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增RO... 目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP18基因,并对其产物进行测序;采用在线生物软件预测TgROP18蛋白的结构与功能。结果 TgROP18基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为1 665bp;测序分析显示,ROP18基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致。TgROP18蛋白含有554个氨基酸,分子式为C2753H4405N801O811S20,分子质量单位为62.34ku,理论等电点为9.34;在TgROP18蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为41.52%、19.13%、7.76%和31.59%;TgROP18蛋白含有10个亲水性较高的区域(临界值为2.0),28个表面可及性较高的区域(临界值为1.9),10个保守结构区域,7个翻译后修饰位点,21个B细胞抗原表位,21个CTL抗原表位及26个Th抗原表位有。结论生物信息学分析表明,TgROP18蛋白具有良好的免疫原性,这将为弓形虫疫苗的研究提供基础资料。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 rop18 克隆 真核表达质粒 生物信息学分析

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弓形虫ROP18基因原核表达载体的构建及表达 被引量：10

3

作者 赵焕阁 韦祎 +3 位作者 黄用豪 梁丽娟 林映莹 谭光宏 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第6期527-529,534,共4页

目的采用PCR方法从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增弓形虫ROP18基因,构建原核表达载体pET-ROP18,并检测融合蛋白ROP18的免疫反应原性。方法采用PCR技术扩增弓形虫ROP18基因,将其插入原核表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-ROP18,PC... 目的采用PCR方法从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增弓形虫ROP18基因,构建原核表达载体pET-ROP18,并检测融合蛋白ROP18的免疫反应原性。方法采用PCR技术扩增弓形虫ROP18基因,将其插入原核表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-ROP18,PCR和双酶切鉴定正确的重组质粒pET-ROP18转入大肠埃希菌BL21中,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白,诱导产物裂解后进行SDS-PAGE电泳,观察重组蛋白的诱导表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出约1.6kb的ROP18基因片段。将其定向插入原核表达载体pET-28a,构建原核表达质粒pET-ROP18,经PCR和双酶切鉴定后测序,显示重组质粒包含ROP18蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP18抗原蛋白。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达分子质量单位约63ku的融合蛋白,以37℃1mmol/L IPTG诱导4h表达量最大。Western blot分析重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功构建了原核表达载pET-ROP18,重组蛋白ROP18具有免疫反应原性。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达

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刚地弓形虫强毒株棒状蛋白ROP18的克隆、表达和免疫反应性分析 被引量：10

4

作者 张颖 张进顺 +3 位作者 贾晓辉 贾天军 卢致民 周芳 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期446-449,共4页

目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入... 目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白TgROP18的表达情况。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blot-ting)分析该重组蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增获得TgROP18基因,长约1 665 bp,编码554个氨基酸,其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgROP18构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)为59 800的可溶性重组蛋白TgROP18。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。结论重组蛋白TgROP18具有一定的免疫反应性。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 rop18 原核表达

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顶复门原虫棒状体蛋白ROP18的研究进展 被引量：3

5

作者 石凯 黄燕 +3 位作者 陈兆国 邓俊良 米荣升 周鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期645-650,共6页

顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry p... 顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子。其中ROP18是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的ROP2家族蛋白成员之一,在刚地弓形虫入侵宿主细胞阶段发挥重要作用,是纳虫空泡(PV)形成时宿主细胞免疫的抑制因子。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。本文以目前研究最多的刚地弓形虫ROP18为主,对其发现历史、结构、分泌及定位、对宿主的毒力机制及应用现状做一综述。 展开更多

关键词 顶复门原虫 棒状体 rop18 综述

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弓形虫棒状体蛋白ROP18的原核表达及其免疫保护性研究 被引量：6

6

作者 许越 张莹光 +4 位作者 徐丹 曹利利 王巍 魏峰 刘全 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第8期708-711,共4页

目的克隆弓形虫ROP18基因并构建该基因的原核表达系统。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP18序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增ROP18抗原基因,并亚克隆到pET-28a原核表达载体,重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,重组... 目的克隆弓形虫ROP18基因并构建该基因的原核表达系统。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP18序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增ROP18抗原基因,并亚克隆到pET-28a原核表达载体,重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,重组蛋白用SDS-PAGE及Western blot鉴定。重组蛋白经纯化后免疫小鼠,ELISA法检测血清抗弓形虫IgG,并通过攻虫试验观察重组蛋白的免疫保护作用。结果成功构建了ROP18基因原核表达质粒pET-28a-ROP18,表达重组蛋白的分子质量单位约为55ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫多抗血清识别;经ELISA检测,重组蛋白免疫小鼠产生了较高水平的血清抗体;攻虫试验中,重组蛋白免疫小鼠生存时间较对照组小鼠显著延长(P<0.05)。结论成功构建了ROP18基因原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的免疫保护作用。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达

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弓形虫ROP18-MIC2重组真核质粒的构建与表达 被引量：3

7

作者 陈琳 何深一 +5 位作者 石娜 周怀瑜 丛华 白杨 赵广会 赵群力 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2012年第8期62-67,共6页

目的构建弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和微线体蛋白2(MIC2)的基因融合的重组真核表达质粒,并在转录和翻译水平进行鉴定。方法利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,体外转染人包皮成纤... 目的构建弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和微线体蛋白2(MIC2)的基因融合的重组真核表达质粒,并在转录和翻译水平进行鉴定。方法利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,体外转染人包皮成纤维细胞(HFF),采用RT-PCR在48 h时检测转录水平,SDS-PAGE在72 h时检测蛋白表达。结果重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2构建正确,经RT-PCR、SDS-PAGE鉴定,弓形虫ROP18、MIC2可在HFF细胞中瞬时表达。结论成功获得重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。 展开更多

关键词 弓形虫属 基因 rop18 基因 MIC2 克隆 分子 真核细胞

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酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白 被引量：4

8

作者 都建 安然 +2 位作者 程里 陈滢 沈继龙 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期18-22,共5页

目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自... 目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用,利用酵母双杂交系统从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白。结果构建了诱饵载体pGBKT7-ROP18,ROP18具有自激活功能。用ROP18^(25-25lan)为诱饵,筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白:DNA损伤特异性结合蛋白1(DDB1)、torsin A相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、整联蛋白β1(integrinβ1)、溶质运载蛋白3(SLC3A2)、酪氨酸硫化转移酶2(TPST2)、Derl样域家族成员2(DERL2)和OCIA结构域蛋白1(OCIAD1)。结论通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18^25-251aa 酵母双杂交 相互作用 宿主蛋白

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弓形虫毒力决定因子Rop18的研究进展 被引量：5

9

作者 尹昆 张佃波 闫歌 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第11期1051-1055,共5页

Rop18是一种通过数量性状遗传位点等分析手段新近发现的弓形虫毒力决定因子,其基因的高表达与强毒Ⅰ型RH株对实验小鼠模型的急性毒力直接相关。Rop18可通过其丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,干扰宿主细胞由IFN-(诱导表达的免疫相关GTP酶IRG... Rop18是一种通过数量性状遗传位点等分析手段新近发现的弓形虫毒力决定因子,其基因的高表达与强毒Ⅰ型RH株对实验小鼠模型的急性毒力直接相关。Rop18可通过其丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,干扰宿主细胞由IFN-(诱导表达的免疫相关GTP酶IRGs蛋白以及内质网相关转录因子ATF6(的抗弓形体机制,使弓形虫具备强毒力。目前对Rop18的研究已成为棒状体蛋白激酶家族的研究热点。本文综述了Rop18的发现过程、序列和结构特征、作用机制和应用前景等方面的研究进展。 展开更多

关键词 rop18 IRGs 棒状体蛋白激酶 毒力决定因子 弓形虫 综述

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弓形虫棒状体蛋白ROP18的优化表达 被引量：1

10

作者 程正阳 苏蕊 +3 位作者 张贤 李叶林 朱万博 余莉 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第4期345-349,共5页

目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18原核表达载体,并通过密码子优化等方法优化其表达。方法运用RT-PCR扩增ROP18基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18重组质粒;运用OptigeneTM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行... 目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18原核表达载体,并通过密码子优化等方法优化其表达。方法运用RT-PCR扩增ROP18基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18重组质粒;运用OptigeneTM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行优化,合成优化后的全长基因(ROP18u)并将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18u重组质粒;以优化后的ROP18u基因为模板,PCR扩增去除N端信号肽和前功能区序列的截短ROP18片段(ROP18uc),将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18uc重组质粒。所有重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白,并进行Western blot鉴定。结果 pGEX-ROP18、pGEX-ROP18u和pGEX-ROP18uc于30℃诱导培养4h-6h,分别检测到分子质量约为88ku和77ku的重组蛋白,该蛋白能被GST单克隆抗体和ROP18多克隆抗体识别。结论成功构建了pGEX-ROP18、pGEX-ROP18u和pGEX-ROP18uc原核表达载体,密码子优化未能显著提高ROP18重组蛋白的表达量,但提高了可溶性蛋白的含量。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达

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刚地弓形虫Rop18基因的原核表达及鉴定

11

作者 曲道峰 韩剑众 杜爱芳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第10期72-75,共4页

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性... 利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18基因 克隆 原核表达

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弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定 被引量：5

12

作者 李博 魏峰 +4 位作者 刘全 马洪霞 许越 金洪涛 商立民 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第2期1-4,共4页

用PCR方法从弓形虫RH株全基因组中扩增ROP18基因,将其克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-ROP18;利用电转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,G418筛选阳性克隆;阳性克隆分离培养后提取基因组,用RO... 用PCR方法从弓形虫RH株全基因组中扩增ROP18基因,将其克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-ROP18;利用电转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,G418筛选阳性克隆;阳性克隆分离培养后提取基因组,用ROP18特异性引物及同源重组鉴定引物进行重组利什曼原虫PCR鉴定,结果阳性虫体中扩增出特异性目的条带;应用鼠抗弓形虫多抗血清以Western blot印记法从蛋白水平进行重组蛋白检测,证明目的蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。 展开更多

关键词 蜥蜴利什曼原虫 弓形虫rop18基因 重组蛋白

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弓形虫ROP5与ROP18的双基因缺失株构建及表型鉴定 被引量：3

13

作者 陈芸 刘旗 +3 位作者 张曼玉 耿小玲 蒋蔚 王权 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期1-11,共11页

ROP5与ROP18都是弓形虫重要的毒力因子,本研究旨在构建弓形虫RH株ROP5单基因缺失株,在此基础上构建ROP5与ROP18的双基因缺失株,并研究ROP5基因、ROP18基因的表型功能,为探究两个基因的协同作用奠定基础。首先构建质粒pSAG1:CAS9::TgU6:s... ROP5与ROP18都是弓形虫重要的毒力因子,本研究旨在构建弓形虫RH株ROP5单基因缺失株,在此基础上构建ROP5与ROP18的双基因缺失株,并研究ROP5基因、ROP18基因的表型功能,为探究两个基因的协同作用奠定基础。首先构建质粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5、pROP5::DHFR-D质粒,并将质粒电转至弓形虫RH株速殖子,经息疟定筛选及PCR鉴定;再将质粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP18、pROP18::CAT-D电转至鉴定正确的ROP5单基因缺失株(ROP5-KO)速殖子中,经氯霉素筛选并进行PCR鉴定。结果显示:本试验成功获得ROP5-KO株及ROP5与ROP18的双基因缺失株(ROP5/ROP18-KO);两个基因同时缺失可明显降低弓形虫的入侵能力及生长速度;此外,双基因缺失后,弓形虫对小鼠的毒力明显减弱。本研究表明,同时敲除ROP5基因与ROP18基因后,弓形虫毒力显著降低,为进一步探究ROP5与ROP18的协同作用奠定了基础。 展开更多

关键词 弓形虫 CRISPR/Cas9 基因敲除 ROP5基因 rop18基因

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弓形虫ROP18蛋白激酶在酵母中的表达纯化及激酶活性鉴定 被引量：1

14

作者 侯永恒 郝桃方 +4 位作者 廖婉琴 杨兆收 潘爱华 吴忠道 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2016年第6期687-690,共4页

目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP1... 目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP18转化至Y258酵母菌株中并诱导表达,表达产物纯化后通过SDS-PAGE进行纯度鉴定;最后通过激酶活性实验对纯化的重组蛋白进行激酶活性鉴定。结果构建了弓形虫ROP18激酶重组表达质粒pEGH-A-ROP18和pEGH-A-ROP18-KD,并成功在酵母表达系统表达弓形虫ROP18重组蛋白,其分子量约为8.2×10 4 Mr,SDS-PAGE蛋白电泳显示为单一条带,并具有较高的激酶活性。结论利用酵母细胞表达系统成功表达并纯化了有激酶活性的弓形虫ROP18蛋白激酶。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 酵母表达 纯化 激酶活性

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弓形虫TR与ROP18双基因缺失及对NF-κB-IL-12-ROS信号通路相关因子的影响 被引量：2

15

作者 耿小玲 陈芸 +4 位作者 刘旗 张曼玉 蒋蔚 段倩玉 王权 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期1-12,共12页

为探究弓形虫的TR与ROP18基因对NF-κB-IL-12-ROS信号通路的影响和抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TR与ROP18双基因敲除株(TR-ROP18-KO)。通过检测TR/ROP18单、双基因缺失株氧化应激水平以及对小鼠巨... 为探究弓形虫的TR与ROP18基因对NF-κB-IL-12-ROS信号通路的影响和抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TR与ROP18双基因敲除株(TR-ROP18-KO)。通过检测TR/ROP18单、双基因缺失株氧化应激水平以及对小鼠巨噬细胞活性氧(ROS)水平影响的研究发现,TR-ROP18-KO株引发的氧化应激水平极显著高于RH株(P<0.01),但与TR单基因缺失株无显著差异(P>0.05);利用RT-PCR检测TR/ROP18单、双基因缺失株感染小鼠巨噬细胞产生的NF-κB、IL-12 mRNA水平和ELISA检测小鼠血清中IL-12的水平发现,TR-ROP18-KO株感染组虽然极显著高于RH株感染组(P<0.01),但TR-ROP18-KO株感染组却未显著高于TR-KO株感染组(P>0.05),表明弓形虫TR与ROP18基因在抗宿主ROS损伤中不存在协同作用。本研究利用TR与ROP18双基因缺失株能够明确解析这两个基因在抗宿主ROS损伤中有无协同作用,为深入研究这两个基因在I型弓形虫免疫逃避途径中的协同作用奠定基础,这也为后续弓形虫双基因功能协同作用的研究提供了一个新思路。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 CRISPR/Cas9 TR rop18 免疫逃避

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弓形虫RH株ROP18基因的原核表达及鉴定 被引量：2

16

作者 段倩玉 蒋蔚 +3 位作者 陈芸 张曼玉 曹敬政 王权 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第5期48-54,共7页

为了研究刚地弓形虫ROP18的生物学功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所发挥的作用,本研究进行了弓形虫RH株ROP18基因的表达与鉴定。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中后,转化大肠埃希菌BL21(D... 为了研究刚地弓形虫ROP18的生物学功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所发挥的作用,本研究进行了弓形虫RH株ROP18基因的表达与鉴定。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot及IFA鉴定重组蛋白的免疫活性。结果表明:以弓形虫RH株基因组DNA为模板,成功扩增出长约678 bp的ROP18截短基因,并构建了原核表达质粒pET-30a-ROP18,测序结果与GenBank参考序列比对,同源性为100%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白ROP18以包涵体形式存在,分子质量约为31 kDa,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L、37℃诱导表达6 h时,表达量最高;Western blot结果显示重组蛋白ROP18可被感染弓形虫的犬阳性血清识别,表明ROP18有良好的反应原性;IFA结果显示,ROP18主要分布于弓形虫速殖子的胞浆内,且棒状体常存在的部位呈现较强荧光。本研究成功获得重组蛋白ROP18及针对ROP18蛋白的多克隆抗体,为ROP18特性与功能的研究奠定基础。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达 多克隆抗体

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荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫株的构建及验证 被引量：1

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作者 郝桃方 李文洁 +2 位作者 杨子帆 杨兆收 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2017年第8期991-995,F0003,共6页

目的构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础。方法利用PCR技术扩增出目的片段ROP18-Ty1和带ROP18-Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达R... 目的构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础。方法利用PCR技术扩增出目的片段ROP18-Ty1和带ROP18-Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达ROP18-Ty1又含荧光素酶标记的质粒P-ROP18-Ty1-LUC。将质粒PROP18-Ty1-LUC和筛选质粒P-TUB-CAT-SAG1通过电转染的方法转染到RH株弓形虫,经过氯霉素筛选和极限稀释得到目的弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株。构建成功的弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株在基因、蛋白、动物水平进行验证。结果利用重组克隆系统成功构建了质粒P-ROP18-Ty1-LUC,利用双酶切实验和测序验证了序列的正确性。以弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株基因组为模板,用特异引物能PCR扩增出1 704 bp大小的ROP18-Ty1和1 644 bp大小的LUC基因;用特异抗体anti-Ty1通过Western blot检测外源蛋白ROP18-Ty1的表达,在56 000 Mr处有单一条带;用荧光素酶报告基因检测系统检测LUC的表达,利用多标记酶标仪检测到荧光的发射;通过活体成像系统检测ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫株在小鼠体内的增殖,与对照组相比感染了ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫株的小鼠体内photon值明显更多(P<0.05);最后小鼠毒力实验也验证了ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫毒力比RH-LUC弓形虫的毒力强(P<0.05)。结论成功构建和验证荧光素酶标记的ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,可以在动物个体水平更客观统计ROP18对弓形虫增殖速率的影响。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 荧光素酶 毒力

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弓形虫棒状体蛋白ROP18表位肽抗体的制备与初步应用 被引量：1

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作者 朱进进 程正阳 余莉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期48-54,共7页

设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备... 设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备抗ROP18血清,通过ELISA鉴定其效价,Western blot鉴定其特异性,并将这两种抗体应用于免疫荧光和免疫共沉淀技术。间接ELISA结果显示两种抗体效价分别为1∶16 000、1∶64 000;Western blot结果显示,两种抗体均能够特异性识别弓形虫速殖子中的内源性天然ROP18蛋白和外源重组ROP18蛋白;免疫荧光检测到ROP18定位于弓形虫速殖子顶端及感染细胞的纳虫泡膜上;免疫共沉淀未能成功下拉目标蛋白。成功获得ROP18的两种表位肽多克隆抗体,效价高且特异性强,并成功应用于免疫荧光定位,为进一步探究ROP18在弓形虫中的功能和作用奠定了基础。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 免疫荧光 免疫共沉淀

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流行于我国的优势基因型弓形虫株毒力及其棒状体蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差异分析 被引量：2

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作者 徐婷 王聪 +1 位作者 罗庆礼 沈继龙 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2018年第11期1695-1699,共5页

目的分析流行于我国的优势基因型弓形虫株(WH3株和WH6株)毒力差异以及棒状体蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差异,为研究其致病机制奠定基础。方法使用弓形虫WH3、WH6、RH和PRU虫株分别感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠,观察小鼠存活时间和存活率,... 目的分析流行于我国的优势基因型弓形虫株(WH3株和WH6株)毒力差异以及棒状体蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差异,为研究其致病机制奠定基础。方法使用弓形虫WH3、WH6、RH和PRU虫株分别感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠,观察小鼠存活时间和存活率,分析毒力强弱。同时PCR扩增4株弓形虫毒力相关效应分子棒状体蛋白ROP5和ROP18基因片段,核苷酸测序后将其转换为氨基酸序列,在蛋白水平上比较其序列差异。结果此4株弓形虫株中,WH3和RH株对BALB/c小鼠和昆明鼠均有较强的毒性,两种小鼠分别在感染后5~7 d和9~12 d均100%死亡;而WH6和PRU株对BALB/c小鼠和昆明鼠的毒性均较弱,两种小鼠在感染后45 d均100%存活,且在脑内检出包囊。棒状体蛋白家族毒力相关分子ROP5和ROP18的氨基酸序列分析发现,Chinese 1型虫株WH3和Wh6与PRU型虫株(Ⅱ型虫株)差异较小,而与毒力较强的RH型虫株(Ⅰ型虫株)差异较大。结论我国流行优势基因型弓形虫株的毒力相关分子ROP5和ROP18,与传统Ⅰ型、Ⅱ型弓形虫株存在差异,为我国弓形虫病的防治提供理论基础。 展开更多

关键词 弓形虫 毒力 ROP5基因 rop18基因

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弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响 被引量：3

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作者 张贤 甘小凤 +4 位作者 程正阳 都建 罗庆礼 沈继龙 余莉 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期234-239,共6页

目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMVGFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架... 目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMVGFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定。以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况。转染48h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。结果重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达。转染48h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05);转染24h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 神经干细胞C17.2 重组腺病毒 细胞凋亡

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