目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31的shRNA片段克隆到慢病毒表达载体p Green Puro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装质粒PMD、SPA共转染...目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31的shRNA片段克隆到慢病毒表达载体p Green Puro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装质粒PMD、SPA共转染293T细胞,在24 h、48 h分2次收集慢病毒上清,用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染HEK293细胞,提取细胞蛋白,Real-time PCR以及Western Blot检测RNF31干涉效果;报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB转录活性的影响;Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响;Western Blot检测下调RNF31对IκBα活化的影响;Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒p Green Puro-RNF31载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度可达3×107pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31,抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性,并抑制NF-κB下游靶基因的表达;下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化;此外,在TNF-α刺激细胞24 h时,RNF31表达下调使细胞凋亡增多。结论 RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。展开更多
