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敲低RNF145表达对SK-HEP-1细胞生物学行为的影响
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作者 杨志钊 陈家兴 +2 位作者 崔永强 赵志磊 张晓 《中华实用诊断与治疗杂志》 2025年第7期597-610,共14页
目的 基于生物信息数据库分析肝细胞癌(HCC)组织RNF145表达与HCC患者预后、基因突变、临床特征、免疫细胞和免疫检查点间的关系,采用细胞实验验证RNF145对SK-HEP-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨其作用机制。方法 (1)采用TIMER数据库... 目的 基于生物信息数据库分析肝细胞癌(HCC)组织RNF145表达与HCC患者预后、基因突变、临床特征、免疫细胞和免疫检查点间的关系,采用细胞实验验证RNF145对SK-HEP-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨其作用机制。方法 (1)采用TIMER数据库分析33种恶性肿瘤组织中RNF145的表达情况。比较TCGA数据库357例HCC患者癌组织及50份正常组织RNF145 mRNA相对表达量;比较357例HCC患者不同T分期、病理分级、临床分期者癌组织RNF145 mRNA相对表达量。以癌组织RNF145 mRNA相对表达量均数(3.86)为界,将357例HCC患者分为高表达组178例(RNF145 mRNA相对表达量≥3.86)和低表达组179例(RNF145 mRNA相对表达量<3.86),绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较RNF145高表达组与低表达组总生存率、无疾病生存率和无进展生存率;采用单因素和多因素Cox回归分析357例HCC患者死亡的影响因素。根据TCGA数据库357例HCC患者癌组织DNA甲基化情况,分析癌组织RNF145表达与DNA甲基化的相关性,鉴定潜在的CpG位点,分析甲基化位点与RNF145表达的相关性。以与RNF145表达具有相关性的特异性甲基化位点(cg02298193、cg06030535、cg11495854、cg01657408)表达的中位数(0.077、0.590、0.075、0.050)为界,以大于等于中位数为高表达、小于中位数为低表达,通过Kaplan-Meier生存曲线比较特异性甲基化位点高、低表者总生存率。应用cBioPortal数据库分析HCC组织RNF145突变频率。应用COSMIC数据库分析RNF145在HCC中常见的突变类型及碱基改变。应用TCGA数据库分析357例HCC患者RNF145高、低表达组癌组织的基因突变情况。应用TCGA数据库分析HCC组织中与RNF145表达呈正、负相关的前5个基因,对其进行KEGG通路富集分析,采用TCGA、ICGC数据库验证与RNF145表达相关的信号通路。应用TIMER数据库分析RNF145表达与免疫细胞和免疫检查点的关系。(2)取2017年3月—2019年1月河南省人民医院3例HCC患者手术切除的癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法检测RNF145表达。(3)取对数生长期SK-HEP-1细胞,分为敲低组(转染RNF145 siRNA)、空载组(转染RNF145 siRNA-NC)、甲基化组(采用S-腺苷基甲硫氨酸诱导甲基化)和对照组(正常培养不做处理),采用实时荧光定量PCR法检测4组RNF145 mRNA相对表达量。检测敲低组和空载组细胞划痕愈合率、侵袭细胞数和细胞增殖率。结果 (1)TIMER数据库分析结果显示,RNF145在胆管癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、HCC、胃癌、子宫内膜癌组织中表达均升高。TCGA数据库分析结果显示,HCC患者癌组织RNF145 mRNA相对表达量(2.34±0.70)高于正常组织(1.91±0.50)(t=4.125,P<0.001)。T1~T2期、病理分级G1~G2级、临床分期Ⅰ~Ⅱ期的HCC患者癌组织RNF145 mRNA相对表达量分别低于T3~T4期、G3~G4级、Ⅲ~Ⅴ期者(t=3.879~4.174,P均<0.001)。RNF145高表达组总生存率(42.9%)、无疾病生存率(37.5%)、无进展生存率(48.2%)均低于RNF145低表达组(61.4%、54.4%、65.8%)(χ^(2)=5.914~13.390,P均<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,RNF145表达(HR=1.040,95%CI:1.006~1.074,P=0.020)、T分期(HR=1.675,95%CI:1.288~2.177,P<0.001)是HCC患者死亡的影响因素。HCC患者癌组织RNF145表达与RNF145甲基化程度呈负相关(r=-0.260,P<0.001)。RNF145的启动子区域鉴定出10个潜在的CpG位点,特异性CpG位点cg06030535(r=-0.170,P=0.0014)、cg02298193(r=-0.110,P=0.032)、cg11495854(r=-0.210,P<0.001)、cg01657408(r=-0.270,P<0.001)的甲基化程度与RNF145表达均呈负相关。甲基化位点cg06030535、cg02298193、cg11495854低表达者总生存率(50.88%、55.56%、55.00%)分别高于高表达者(48.49%、38.10%、46.67%)(χ^(2)=5.907~15.870,P均<0.05)。cBioPortal数据库分析结果显示,RNF145体细胞突变总体频率为0.7%,且大多数为错义突变,显著低于TP53和CTNNB1等核心驱动基因。COSMIC数据库分析结果显示,RNF145突变类型主要为错义突变(35.00%),其次为同义突变(12.70%),多数碱基改变替换涉及C>T(23.43%)、A>G(16.86%)、G>A(21.43%)。TCGA数据库分析结果显示,RNF145高、低表达组均有TP53、CTNNB1、TTN和MUC16突变发生,高表达组TP53突变频率(31%)较高。TCGA数据库基因的相关性分析结果显示,与RNF145表达呈正相关的前5个基因为SLC38A1、ACTR3、STK17A、TMEM87B、CDC42SE2,呈负相关的前5个基因为CYP27A1、AGXT、RBP4、SERPINC1、PIPOX,均富集于WNT信号通路;进一步验证结果显示,高表达RNF145可激活WNT信号通路,RNF145表达与WNT信号通路相关。RNF145表达与免疫细胞B细胞(r=0.323,P<0.001)、CD8+T细胞(r=0.249,P<0.001)、CD4+T细胞(r=0.491,P<0.001)、巨噬细胞(r=0.561,P<0.001)、中性粒细胞(r=0.499,P<0.001)、树突状细胞(r=0.431,P<0.001)、CD163(r=0.310,P<0.001)、MS4A4A(r=0.300,P<0.001)、VSIG4(r=0.330,P<0.001)、CD96(r=0.280,P<0.001)、IDO1(r=0.180,P<0.001)、PDCD1(r=0.320,P<0.001)、CD276(r=0.510,P<0.001)、CTLA4(r=0.340,P<0.001)、HAVCR2(r=0.470,P<0.001)、CD274(r=0.270,P<0.001)表达均呈正相关。(2)HCC组织RNF145表达(0.052±0.001)高于癌旁组织(0.030±0.003)(t=8.857,P<0.001)。(3)RNF145mRNA相对表达量在敲低组细胞(0.603±0.056)低于空载组(1.004±0.066)(t=7.997,P<0.001)、甲基化组细胞(0.293±0.183)低于对照组(1.058±0.415)(t=3.378,P=0.015)。敲低组细胞划痕愈合率、侵袭细胞数和细胞增殖率[(46.743±4.911)%、(175.57±62.70)个、(0.882±0.053)%]均低于空载组[(71.680±6.062)%、(322.50±139.70)个、(1.376±0.044)%](t=6.584、10.880、18.710,P均<0.001)。结论 RNF145在HCC组织中呈高表达,其表达与肿瘤恶性程度及不良预后相关;敲低RNF145表达可抑制SK-HEP-1细胞增殖、迁移及侵袭,其机制可能与WNT信号通路激活及肿瘤免疫微环境调控有关。 展开更多
关键词 肝细胞癌 rnf145 细胞增殖 迁移 侵袭 WNT信号通路
原文传递
鲤环指蛋白145基因克隆、生物信息学及功能分析 被引量：1
2
作者 郭朝辉 张子豪 +5 位作者 李海洁 张美娜 江鑫 于光晴 李明 刘变枝 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期3882-3895,共14页
【目的】试验旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)环指蛋白145(ring finger protein145,RNF145)基因CDS区,并对其进行生物信息学分析及功能初探。【方法】对鲤RNF 145基因进行了克隆并测序,通过在线软件对鲤RNF145蛋白进行生物信息学分析;采用... 【目的】试验旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)环指蛋白145(ring finger protein145,RNF145)基因CDS区,并对其进行生物信息学分析及功能初探。【方法】对鲤RNF 145基因进行了克隆并测序,通过在线软件对鲤RNF145蛋白进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析鲤RNF 145基因在不同发育阶段、不同组织中及在鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp virus,SVCV)和Poly(I∶C)刺激下的mRNA表达变化。【结果】鲤RNF 145基因CDS序列全长2049 bp,编码682个氨基酸,其氨基酸序列与鲫相似性最高;鲤RNF145蛋白分子质量为76.56 ku,理论等电点为6.16,脂肪系数为115.32%,不稳定指数为41.87,无信号肽,含有11个跨膜螺旋,属跨膜蛋白;亚细胞定位预测结果显示,其定位于细胞质膜(87%)和内质网(13%);该蛋白含有TRC8-N、RING_H2_RNF145和RAD18结构域,具有α-螺旋(56.45%)、延伸链(9.68%)、β-转角(2.35%)及无规则卷曲(31.52%),与MFN2、NUGGC.1、ASZ1和TRIM36相互作用的置信度较高。早期发育阶段鲤RNF 145基因mRNA表达呈先显著下降后上升,再显著下降趋势(P<0.05);组织表达谱分析表明,其在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低;SVCV1(5.6×107 TCID 50/mL)在体感染24 h后,RNF 145基因在肌肉、脾脏、头肾、心脏中表达量均显著升高,在肝脏中则显著下降(P<0.05);该剂量感染鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum crprini,EPC)时,RNF 145基因表达量在12 h时开始显著升高,于48 h时仍显著高于对照组(P<0.05);SVCV2(5.6×104 TCID 50/mL)感染EPC时,鲤RNF 145基因mRNA表达量在感染后24 h时显著高于对照组,48 h后显著低于对照组(P<0.05)。与SVCV1刺激结果不同,在体注射Poly(I∶C)(1000μg/mL)24 h后,该基因在脾脏和头肾中表达量均显著低于对照组(P<0.05);Poly(I∶C)(10μg/mL)感染EPC时,鲤RNF 145基因mRNA表达量在感染后24 h时显著高于对照组,48 h后显著低于对照组(P<0.05)。【结论】本试验成功克隆了鲤RNF 145基因的CDS全长序列,揭示了其在不同组织、早期不同发育阶段及SVCV和Poly(I∶C)刺激下的表达变化,为进一步研究该基因功能提供了前期基础。 展开更多
关键词 鲤 RNF 145基因 克隆 生物信息学 鲤春病毒血症病毒 Poly(I∶C)
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