目的探讨聚(rC)结合蛋白1[Poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]在镉(Cadmium,Cd)诱导小鼠神经细胞Neuro-2a(N2A)铁死亡中的作用。方法以N2A细胞构建浓度梯度(0、1、2、4μmol/L)CdCl_(2)体外暴露模型(72 h)。通过台盼蓝染色检测细胞存活...目的探讨聚(rC)结合蛋白1[Poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]在镉(Cadmium,Cd)诱导小鼠神经细胞Neuro-2a(N2A)铁死亡中的作用。方法以N2A细胞构建浓度梯度(0、1、2、4μmol/L)CdCl_(2)体外暴露模型(72 h)。通过台盼蓝染色检测细胞存活率,Western blot分析铁死亡相关蛋白(GPX4、HMOX1、ACSL4)及PCBP1表达。以FerroOrange和BODIPY^(581/591)C11探针检测胞内Fe^(2+)和脂质过氧化水平。应用铁死亡抑制剂Fer-1明确铁死亡在镉暴露抑制N2A细胞存活率中的重要作用。以分子对接技术解析PCBP1与铁蛋白的互作模式及与Cd^(2+)的结合位点。进一步构建PCBP1过表达质粒验证其重要作用及功能。结果镉暴露以剂量依赖性方式抑制细胞存活率(P<0.01),显著下调GPX4表达水平(P<0.05),上调HMOX1表达水平(P<0.01),诱导Fe^(2+)过量蓄积及脂质过氧化水平显著增加(P<0.01)。分子对接揭示,Cd^(2+)可直接结合PCBP1的KH2结构域,并且可共同结合于铁蛋白重链外侧。过表达PCBP1可明显逆转镉暴露诱导的Fe^(2+)蓄积、GPX4表达下调、过氧化脂质增加及细胞存活率下降。结论镉暴露通过抑制PCBP1表达及以金属离子竞争扰乱PCBP1介导的铁稳态网络,协同驱动Fe^(2+)超载触发铁死亡级联反应,最终导致神经毒性。靶向PCBP1介导的铁稳态可有效抑制铁死亡,为干预镉神经毒性提供新策略。展开更多
目的探究受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2,ROR2)是否通过调控聚(rc)结合蛋白1[poly(rc)-inding protein 1,PCBP1)]激活PI3K/AKT信号通路,从而调控胃癌细胞增殖、侵袭和细胞周期进程。方法...目的探究受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2,ROR2)是否通过调控聚(rc)结合蛋白1[poly(rc)-inding protein 1,PCBP1)]激活PI3K/AKT信号通路,从而调控胃癌细胞增殖、侵袭和细胞周期进程。方法将胃癌细胞HGC-27通过免疫共沉淀/高效液相色谱联合质谱(co-immunoprecipitation/liquid chromatography-tandem mass spectrometry,Co-IP/LC-MS/MS)分析鉴定出ROR2潜在相互结合蛋白。通过Co-IP实验及蛋白-蛋白对接实验检测PCBP1与ROR2的相互结合。通过Western blot实验检测人胃癌细胞AGS、MKN-45、HGC-27及MGC-803中ROR2降表达及过表达后PCBP1的蛋白表达情况。通过Western blot、生长指数(growth index,GI)和Transwell实验检测ROR2通过PCBP1对PI3K/AKT信号通路及胃癌细胞增殖、侵袭和细胞周期进程的调控情况。通过免疫组织化学染色技术(immunohistochemistry,IHC)检测人胃癌临床样本、裸鼠胃癌皮下成瘤组织中ROR2与PCBP1的表达。通过R2在线数据库分析ROR2与PCBP1在胃癌中表达的相关性。结果Co-IP/LC-MS/MS、Co-IP及蛋白-蛋白对接实验表明,ROR2与PCBP1相互结合。Western blot实验表明,在人胃癌细胞中,过表达ROR2上调PCBP1蛋白水平,降表达ROR2下调PCBP1蛋白水平,差异均有统计学意义(P均<0.05)。Western blot、GI及Transwell实验表明,ROR2通过上调PCBP1表达激活PI3K/AKT信号通路,从而促进胃癌细胞增殖、侵袭和细胞周期进程,差异有统计学意义(P均<0.05)。IHC表明,在人胃癌组织及ROR2过表达的裸鼠皮下成瘤组织中,ROR2与PCBP1表达呈正相关,差异均有统计学意义(P均<0.05)。数据库分析表明,ROR2与PCBP1的表达呈正相关,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论ROR2与PCBP1在胃癌中相互作用,ROR2和PCBP1在胃癌中高表达且ROR2在细胞水平、动物水平及临床样本水平都正向调控PCBP1。ROR2通过上调PCBP1蛋白表达激活PI3K/AKT信号通路,从而促进胃癌细胞增殖、侵袭和细胞周期进程。展开更多
文摘目的探讨聚(rC)结合蛋白1[Poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]在镉(Cadmium,Cd)诱导小鼠神经细胞Neuro-2a(N2A)铁死亡中的作用。方法以N2A细胞构建浓度梯度(0、1、2、4μmol/L)CdCl_(2)体外暴露模型(72 h)。通过台盼蓝染色检测细胞存活率,Western blot分析铁死亡相关蛋白(GPX4、HMOX1、ACSL4)及PCBP1表达。以FerroOrange和BODIPY^(581/591)C11探针检测胞内Fe^(2+)和脂质过氧化水平。应用铁死亡抑制剂Fer-1明确铁死亡在镉暴露抑制N2A细胞存活率中的重要作用。以分子对接技术解析PCBP1与铁蛋白的互作模式及与Cd^(2+)的结合位点。进一步构建PCBP1过表达质粒验证其重要作用及功能。结果镉暴露以剂量依赖性方式抑制细胞存活率(P<0.01),显著下调GPX4表达水平(P<0.05),上调HMOX1表达水平(P<0.01),诱导Fe^(2+)过量蓄积及脂质过氧化水平显著增加(P<0.01)。分子对接揭示,Cd^(2+)可直接结合PCBP1的KH2结构域,并且可共同结合于铁蛋白重链外侧。过表达PCBP1可明显逆转镉暴露诱导的Fe^(2+)蓄积、GPX4表达下调、过氧化脂质增加及细胞存活率下降。结论镉暴露通过抑制PCBP1表达及以金属离子竞争扰乱PCBP1介导的铁稳态网络,协同驱动Fe^(2+)超载触发铁死亡级联反应,最终导致神经毒性。靶向PCBP1介导的铁稳态可有效抑制铁死亡,为干预镉神经毒性提供新策略。
