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布鲁氏菌Bp26蛋白单克隆抗体制备及生物学鉴定 被引量:1
1
作者 罗意 马春慧 +5 位作者 郑福英 李永清 樊晓旭 储岳峰 周沛 许健 《中国农业大学学报》 北大核心 2025年第7期139-149,共11页
为制备布鲁氏菌Bp26蛋白单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定,本研究利用原核表达系统制备Bp26重组蛋白,以纯化的Bp26蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对布鲁氏菌Bp26蛋白的单克隆抗体,采用免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定其特... 为制备布鲁氏菌Bp26蛋白单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定,本研究利用原核表达系统制备Bp26重组蛋白,以纯化的Bp26蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对布鲁氏菌Bp26蛋白的单克隆抗体,采用免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定其特异性,并通过ELISA测定亲和力常数及阻断活性,最后采用斑点杂交试验鉴定抗原识别表位。结果表明:1)成功表达布鲁氏菌Bp26蛋白,其相对分子质量在26 ku左右。2)获得2株Bp26单克隆抗体细胞株(6E8和4C4)。免疫印迹显示,2株Bp26单抗与重组Bp26蛋白和布鲁氏菌菌体Bp26蛋白均有较强的特异性反应;间接免疫荧光试验表明,Bp26单抗能够特异性识别感染巨噬细胞的羊种布鲁氏菌M5-90株,但不能识别感染巨噬细胞的M5-90△Bp26株。ELISA显示,单抗6E8和4C4的亲和力常数分别为2.58×10^(-7)和2.34×10^(-7)mol/L,抗体阻断率均达到80%以上。斑点杂交结果显示,单抗6E8识别表位氨基酸序列为23ASPDMAILNL32,单抗4C4为73GINIQPIYVYPD84。综上,本研究成功制备了针对布鲁氏菌Bp26蛋白不同抗原表位的2种单克隆抗体,其具有较好的特异性、结合力及阻断活性,不仅为进一步探索布鲁氏菌Bp26蛋白的生物学特性奠定基础,而且为布鲁氏菌诊断技术的建立提供技术支持。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 单克隆抗体 表位鉴定
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布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究 被引量:10
2
作者 陈瑞花 张辉 +6 位作者 唐利燕 孟茹 张豫 王震 李志强 张俊波 陈创夫 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第16期3406-3413,共8页
【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌b... 【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中,电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中,成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞,BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢,缺失株导致细胞大量脱落溶解,ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著(P<0.01),而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组,LDH和IL-10均低于M5-90对照组,差异显著(P<0.05)。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株,BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应,有细胞毒性作用,bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用,bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 bp26缺失株 细胞因子
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布鲁氏菌BP26蛋白的表达纯化及其抗原性的研究 被引量:8
3
作者 宫晓炜 景涛 +3 位作者 王国治 李恪梅 王秉翔 傅林锋 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1085-1088,共4页
目的获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白。方法应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别... 目的获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白。方法应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别用Western-blot,间接ELISA检测其抗原性。结果DNA测序及酶切鉴定证实PET-30a/bp26原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中高效表达,免疫印迹和间接ELISA实验证明BP26重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清产生特异性结合。结论成功获得了布鲁氏菌中序列全长为696bp,编码232个氨基酸的BP26蛋白,通过血清学反应证实,该蛋白为人和动物布鲁氏菌病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26重组蛋白 抗原性
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牛布鲁氏菌BP26间接ELISA检测方法的建立 被引量:13
4
作者 左玉柱 王增利 +2 位作者 路广计 王振来 郑丽丽 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期223-226,共4页
为建立检测牛布鲁氏菌(Brucella)血清抗体的间接ELISA方法,本研究将原核表达并纯化的Brucella外膜蛋白BP26作为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,经过对各种反应条件进行优化,建立了牛Brucella间接ELISA抗体检... 为建立检测牛布鲁氏菌(Brucella)血清抗体的间接ELISA方法,本研究将原核表达并纯化的Brucella外膜蛋白BP26作为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,经过对各种反应条件进行优化,建立了牛Brucella间接ELISA抗体检测方法。该方法对其他相关的牛病病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。对100份临床血清样品进行检测,同时将建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的同类试剂盒进行比较,符合率为93%。本研究为布鲁氏菌病提供了一种简便的血清学诊断方法。 展开更多
关键词 牛布鲁氏菌 bp26蛋白 间接ELISA
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布鲁氏菌bp26和OMP10基因的原核表达和鉴定 被引量:9
5
作者 陈瑶 李明 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期313-317,共5页
目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-... 目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用western-blot分析重组表达的GST-OMP10和GST-bp26的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了OMP10和bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白OMP10 外膜蛋白bp26 免疫 诊断
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羊布鲁杆菌M5-90BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:1
6
作者 丘金浪 吴静波 +1 位作者 黎诚耀 王文敬 《中国地方病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期361-364,共4页
目的制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5—90BP26抗原单克隆抗体,并对抗体进行鉴定。方法将质粒pET-28a—BP26转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),构建原核表达质粒pET-28a—BP26,用镍离子金属螯合亲和层析法(Ni—NTA)纯化、重组... 目的制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5—90BP26抗原单克隆抗体,并对抗体进行鉴定。方法将质粒pET-28a—BP26转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),构建原核表达质粒pET-28a—BP26,用镍离子金属螯合亲和层析法(Ni—NTA)纯化、重组BP26蛋白(rBP26)。将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原。按每只100μg/0.1ml在BALB/c小鼠皮下多点注射进行初次免疫;2周后,按每只50μg/0.1ml在小鼠皮下多点注射进行再次免疫。再次免疫后2周,小鼠尾静脉取血测效价,检测免疫效果;在细胞融合前3天,将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫。将小鼠骨髓瘤SP2/O细胞与脾细胞按1:5比例在聚乙二醇(PEG)1450作用下进行细胞融合,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;10d后取细胞培养上清液,用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定,筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞;再经过反复3次克隆,筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株,用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体,并以初始杂交瘤细胞克隆号命名。利用羊布鲁杆菌M5~90疫苗株制备膜蛋白提取物(NMP),采用免疫印迹法(Western)及斑点间接酶联免疫吸附法(Dot—ELISA)对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定,用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa(K)和Lambda(入)轻链鉴定。结果成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体,并能与羊布鲁杆菌M5—90疫苗株上的NMP结合,构建成M5—90BP26抗原单克隆抗体,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,轻链均为K链。结论鉴定结果表明,成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体,抗体具有识别M5—90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力,优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5—90疫苗株的改造提供实验依据。 展开更多
关键词 布鲁杆菌 膜间质蛋白bp26 抗体 单克隆
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布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定 被引量:1
7
作者 陈瑶 李明 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2007年第2期256-258,262,共4页
[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接,构建重组质粒PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆... [目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接,构建重组质粒PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中表达该蛋白。用western-blot鉴定重组表达的GST-bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白bp26 免疫 诊断
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布鲁菌bp26基因的原核表达及间接ELISA方法的临床初步应用 被引量:1
8
作者 谷海峰 郭港 +2 位作者 刘雪梅 李天惠 李鲁平 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2015年第3期43-47,共5页
构建诊断人布病的优势抗原BP26原核表达载体,并建立以该蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法。人工合成bp26基因片段,构建原核表达载体pET30a-bp26,并转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,Ni柱亲和纯化BP26重组蛋白,间接ELISA检测其... 构建诊断人布病的优势抗原BP26原核表达载体,并建立以该蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法。人工合成bp26基因片段,构建原核表达载体pET30a-bp26,并转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,Ni柱亲和纯化BP26重组蛋白,间接ELISA检测其抗原活性,并优化间接ELISA方法的各个参数,检测临床大量样本,对该方法性能进行评价。PCR鉴定及DNA测序证实pET30a-1bp26重组质粒构建成功,并在0.8mmol/L IPTG 20℃过夜诱导的条件下大量表达,经亲和纯化获得高纯度的可溶性BP26重组蛋白,间接ELISA结果显示该重组蛋白具有抗原活性,优化参数后,该方法的敏感度为70.00%,特异性为94.74%。成功获得高抗原活性的原核表达可溶性BP26重组蛋白,并建立用于临床特异性诊断人类布病的间接ELISA方法。 展开更多
关键词 bp26重组蛋白 间接ELISA 布鲁菌
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羊种布鲁氏菌BP26蛋白的生物信息学分析 被引量:1
9
作者 赵庆亮 卢梅 +4 位作者 谭艳 冉光鑫 王慧颖 赵新霞 盛金良 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第11期1277-1282,共6页
目的采用生物信息学方法预测羊种布鲁氏菌BP26蛋白的抗原表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的BP26蛋白的氨基酸序列,利用ExPASy蛋白分析在线软件ProtParam、SOPMA、SWISS MODEL、ProtScale、Signal 5.0、TMHMM 2.0、PSOTR,分析BP2... 目的采用生物信息学方法预测羊种布鲁氏菌BP26蛋白的抗原表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的BP26蛋白的氨基酸序列,利用ExPASy蛋白分析在线软件ProtParam、SOPMA、SWISS MODEL、ProtScale、Signal 5.0、TMHMM 2.0、PSOTR,分析BP26蛋白的理化性质,二、三级结构,亲、疏水性,信号肽,跨膜区及亚细胞定位;使用IEDB分析BP26蛋白的B细胞表位;使用PROSITE SCAN分别BP26蛋白的结构域分析。结果BP26蛋白由250个氨基酸组成,分子式为C1152H1898N328O364S12,相对分子质量为26.5×10^3,理论等电点为6.39,不稳定系数为27.93,为稳定蛋白。二级结构以α-螺旋为主,占41.2%;无规卷曲占36.8%,延伸链占17.2%;β-转角占4.8%。预测其三级结构与同源模板S19株BP26蛋白相似性99.55%,16个BP26分子形成一个新颖的通道状结构。BP26蛋白存在1个跨膜区,该跨膜区域位于7-29位氨基酸,可能为信号肽,与信号肽分析结果一致。Signal 5.0分析BP26蛋白在7-29位氨基酸有一个分泌型蛋白信号肽。BP26蛋白包含有14个线性表位,其中以27-42、108-125、224-240位氨基酸区段为BP26蛋白的优势抗原表位区段。BP26蛋白包含2个N-糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化作用位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点,5个N-豆蔻酰基化位点;亚细胞定位分析BP26蛋白为膜周质蛋白。结论生物信息学分析羊种布鲁氏菌BP26蛋白存在多个B细胞抗原表位,可以作为布鲁氏菌诊断和疫苗研究的候选抗原。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 抗原表位 生物信息学分析
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Identification of Brucella melitensis and Molecular Cloning of Its BP26 Gene into p ET24a(+) Vector 被引量:1
10
作者 Feng Ying Wang Yu +3 位作者 Zhao Shihua Gao Wa Zhan Shubai Chen Wei 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2015年第6期358-363,共6页
Brucella spp. are pathogenic to humans and domestic animal. Nowadays,there is no effective vaccine and control strategy in China. So,it is necessary to research effective vaccines for prevention and treatment of this ... Brucella spp. are pathogenic to humans and domestic animal. Nowadays,there is no effective vaccine and control strategy in China. So,it is necessary to research effective vaccines for prevention and treatment of this disease. In order to deal with these,we isolated and identified the type of Brucella in Darhan Muminggan Joint Banner and Siziwang Banner of Inner Mongolia. Totally 26 samples of sheep blood which were positive in serological test,one sample of spleen from aborted and one sample of secretion from birth canal were isolated,and the 16 S r DNA genes of positive samples were sequenced. Phylogenetic analysis proved that there were four isolates similar to B. melitensis. As an important diagnostic antigens of B. melitensis,the BP26 gene was amplified. The BP26 gene was cloned into vector p ET24a( +) and conducted sequence analysis. The BP26 gene was 900 bp,with an open reading frame of 753 bp. The homology of BP26 gene with the vaccine strain M5 was 100%,and that with S2 and A19 vaccine strains was 99. 99%. These finding supported the development of BP26-based specific serodiagnostic test and vaccine for B. melitensis in China. 展开更多
关键词 Brucella melitensis protein bp26 Vector construction
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布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化
11
作者 闫广谋 王兴龙 +7 位作者 张辉 刘锴 庞盼娇 王学理 高健勇 李晓燕 张付贤 王俊霞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第12期887-889,共3页
目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨... 目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。 展开更多
关键词 布鲁菌 bp26蛋白 基因克隆 原核表达 纯化
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布鲁菌外膜蛋白Bp26在大肠埃希菌中的可溶性表达
12
作者 刘晓颖 姚志利 +3 位作者 陈立志 廉士珍 夏小成 冯二凯 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第1期32-35,共4页
为了获得布鲁菌外膜蛋白Bp26活性重组蛋白,以布鲁菌M5株菌体DNA为模板,应用PCR方法扩增得到Bp26基因,将该基因片段克隆到载体pET28a中,转化到E.coli BL21(DE3)中,在不同条件下诱导表达,对获得的菌体细胞超声破碎,通过SDS-PAGE鉴定是否... 为了获得布鲁菌外膜蛋白Bp26活性重组蛋白,以布鲁菌M5株菌体DNA为模板,应用PCR方法扩增得到Bp26基因,将该基因片段克隆到载体pET28a中,转化到E.coli BL21(DE3)中,在不同条件下诱导表达,对获得的菌体细胞超声破碎,通过SDS-PAGE鉴定是否为可溶性表达。结果表明,pET28aBp26重组质粒构建成功;终浓度为1.0mmol/L的IPTG在37℃下诱导,重组蛋白表达量最大;含乳糖成分的ZYM-5052培养基和终浓度为1.0mmol/L的IPTG在相同条件下诱导表达蛋白,ZYM-5052培养基可以更好的获得可溶性表达蛋白,为进一步利用大肠埃希菌系统表达生产高活性重组Bp26蛋白提供了一定的参考依据。 展开更多
关键词 布鲁茵菌 外膜蛋白bp26 乳糖 大肠埃希菌 表达
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流产布鲁菌BP26蛋白B细胞线性表位的鉴定 被引量:1
13
作者 羡东堡 高明春 +2 位作者 曹涤非 王晓东 王君伟 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1444-1448,共5页
为了对流产布鲁菌BP26蛋白进行抗原表位研究,设计了3个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个BP26蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用流产型布鲁菌感染血清对3个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出BP26蛋白B细胞线性... 为了对流产布鲁菌BP26蛋白进行抗原表位研究,设计了3个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个BP26蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用流产型布鲁菌感染血清对3个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出BP26蛋白B细胞线性抗原表位位于第51-165氨基酸区域。在此基础上,针对BP26 2(51-165aa)短肽,设计了5个相互重叠10个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了BP26蛋白B细胞线性表位位于第109-141氨基酸区域。该结果为进一步探索BP26蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 流产布鲁菌 bp26蛋白 B细胞 线性表位 鉴定
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布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备和免疫学评价 被引量:2
14
作者 林海 涂飞 +4 位作者 李楠 孙洋 姜博文 纪雪 刘军 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第6期37-46,共10页
为了构建布鲁氏菌外膜蛋白BP26细菌样颗粒候选疫苗BLPs-BP26,并评价其免疫原性,本试验首先分别扩增羊种布鲁氏菌16M株编码BP26蛋白的整个基因序列和乳酸乳球菌MG1363株编码肽聚糖锚钩蛋白(PA)的整个基因序列,通过重叠延伸PCR技术将bp26... 为了构建布鲁氏菌外膜蛋白BP26细菌样颗粒候选疫苗BLPs-BP26,并评价其免疫原性,本试验首先分别扩增羊种布鲁氏菌16M株编码BP26蛋白的整个基因序列和乳酸乳球菌MG1363株编码肽聚糖锚钩蛋白(PA)的整个基因序列,通过重叠延伸PCR技术将bp26基因与PA基因连接构建融合基因bp26-PA,将融合基因bp26-PA克隆至pET-28a原核表达载体并诱导表达融合蛋白BP26-PA。将表达正确的BP26-PA融合蛋白与细菌样颗粒(BLPs)结合构建BLPs-BP26,通过SDS-PAGE、Western blot、间接免疫荧光和冷冻超薄切片对BLPs-BP26进行鉴定。将BLPs-BP26免疫小鼠,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠特异性IgG抗体水平,实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)分析免疫小鼠脾脏组织中干扰素γ(IFN-γ)和白介素2(IL-2)的基因转录水平,ELISA方法检测免疫小鼠血清中IFN-γ和IL-2的蛋白表达水平。鉴定结果显示,BP26-PA蛋白成功展示在BLPs表面;免疫小鼠试验结果显示,小鼠血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶1 024 000;与PBS组相比,BLPs-BP26组免疫小鼠脾脏组织中IFN-γ和IL-2基因的转录水平均极显著升高(P值分别为P<0.000 1和P<0.01),小鼠血清中IFN-γ的表达水平极显著升高(P<0.000 1)。结果表明,BLPs-BP26能刺激小鼠产生高水平的特异性IgG抗体,并可诱导小鼠产生细胞免疫应答。本试验为开发具有良好免疫原性且无安全隐患的布鲁氏菌新型疫苗提供了新的思路。 展开更多
关键词 表面展示技术 布鲁氏菌 bp26蛋白 细菌样颗粒疫苗
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布鲁氏菌BP26蛋白的原核表达及鉴定 被引量:2
15
作者 鲁友铭 李俊萱 +4 位作者 吴胜昔 曾政 黄恒 李令臣 侯力嘉 《重庆理工大学学报(自然科学)》 CAS 北大核心 2019年第10期185-190,共6页
为了实现布鲁氏菌BP26蛋白在原核宿主细胞进行高效表达,对布鲁氏菌BP26基因进行密码子优化,化学合成了BP26全基因,并将其克隆至pET30a(+)载体上,构建重组质粒pET30a(+)-bp26,转化至基因工程菌BL21(DE3),利用IPTG进行诱导表达。利用His-... 为了实现布鲁氏菌BP26蛋白在原核宿主细胞进行高效表达,对布鲁氏菌BP26基因进行密码子优化,化学合成了BP26全基因,并将其克隆至pET30a(+)载体上,构建重组质粒pET30a(+)-bp26,转化至基因工程菌BL21(DE3),利用IPTG进行诱导表达。利用His-tag镍柱纯化BP26重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果显示:重组质粒经Nde I与Xhol I双酶切,酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳显示与目的产物条带大小一致;当诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L,37℃诱导8 h时,重组蛋白的表达量最高;纯化后的目的蛋白经过Western Blot鉴定,显示在27.8 kD左右有一条明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。本研究成功实现了在大肠杆菌高效表达BP26蛋白,为后续布病检测新试剂的研制及疫苗的研发奠定了生物学基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26重组蛋白 原核表达 镍柱纯化 蛋白免疫印迹
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布鲁氏菌Bp26蛋白原核表达的优化与间接ELISA检测方法的建立 被引量:1
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作者 刘尚博 王振华 +1 位作者 秦建华 郑可 《现代畜牧科技》 2024年第10期27-31,共5页
为原核表达布鲁氏菌Bp26蛋白,利用布鲁氏菌M5-90疫苗株扩增得到Bp26基因片段,克隆构建pET28a-XXA-HRV 3C-Bp26原核表达载体,通过诱导表达和Ni-NTA亲和纯化得到XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,再使用PreScission Protease酶切得到无标签的Bp26... 为原核表达布鲁氏菌Bp26蛋白,利用布鲁氏菌M5-90疫苗株扩增得到Bp26基因片段,克隆构建pET28a-XXA-HRV 3C-Bp26原核表达载体,通过诱导表达和Ni-NTA亲和纯化得到XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,再使用PreScission Protease酶切得到无标签的Bp26蛋白。通过SDS-PAGE和Western Blot试验结果,证明成功表达XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,且蛋白是可溶性表达,并通过酶切获得了无任何标签的Bp26蛋白。以Bp26蛋白做为诊断抗原,初步建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法,通过与商用布鲁氏菌ELISA检测试剂盒对256份羊血清样本进行检测,符合率为93.75%,证明建立的布鲁氏菌间接ELISA检测方法可以做为临床中的一种布鲁氏菌病检测方法。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 间接ELISA
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牛布氏杆菌间接ELISA检测方法的建立 被引量:13
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作者 宫晓炜 邱昌庆 +4 位作者 蔺国珍 郑福英 曹小安 王光华 周继章 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期598-602,共5页
采用原核表达并纯化的布氏杆菌周质蛋白BP26作为包被抗原,建立了检测牛布氏杆菌血清抗体的间接ELISA(iELISA)方法。用建立的iELISA方法对138份临床奶牛血清样本进行了检测,并与虎红平板凝集试验(RBPT)和套式PCR(nested-PCR)进行了比较... 采用原核表达并纯化的布氏杆菌周质蛋白BP26作为包被抗原,建立了检测牛布氏杆菌血清抗体的间接ELISA(iELISA)方法。用建立的iELISA方法对138份临床奶牛血清样本进行了检测,并与虎红平板凝集试验(RBPT)和套式PCR(nested-PCR)进行了比较。结果表明,所建立的iELISA与RBPT和nes-ted-PCR的符合率分别为97.82%和98.55%。尽管该方法的敏感性略低于nested-PCR,但用iELISA检测病牛血清的阳性率可达93.00%。该iELISA方法可作为一种有效的牛布氏杆菌病血清学诊断的备用方法。 展开更多
关键词 牛布氏杆菌 bp26重组蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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鉴别布鲁菌病自然感染动物与疫苗免疫动物胶体金检测试纸条的研制 被引量:12
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作者 张付贤 李晓艳 +5 位作者 闫广谋 唐婕 杨延玲 路浩 郎需龙 王兴龙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第7期79-82,共4页
用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金技术制作金标垫,以亲和层析法纯化的BP26蛋白作为检测抗原(T线),研制胶体金快速检测试纸条。用建立的试纸条检测小鼠布鲁菌感染血清,可成功鉴别牛布鲁菌S19感染和BP26缺失疫苗株YZ-2免疫的小鼠。... 用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金技术制作金标垫,以亲和层析法纯化的BP26蛋白作为检测抗原(T线),研制胶体金快速检测试纸条。用建立的试纸条检测小鼠布鲁菌感染血清,可成功鉴别牛布鲁菌S19感染和BP26缺失疫苗株YZ-2免疫的小鼠。试纸条检测与布鲁菌属同源性较近的几株细菌的阳性血清,结果无交叉反应;试纸条敏感性高于虎红平板凝集试验检测方法,近似于ELISA方法;准确性同于ELISA法,且更为简便快捷。该试纸条具有鉴别布鲁菌病自然感染和疫苗免疫的应用前景。 展开更多
关键词 布鲁菌病 bp26蛋白 胶体金试纸条 鉴别
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牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法的建立及应用 被引量:5
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作者 赵伟栋 韩文瑜 +6 位作者 冮森林 雷连成 王大力 孙长江 李铁峰 杜涛峰 张俊敏 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第12期1244-1246,1250,共4页
目的建立牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用大肠杆菌表达的牛布氏杆菌重组BP26蛋白作为检测抗原,用棋盘滴定法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立间接ELISA方法,并进行验... 目的建立牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用大肠杆菌表达的牛布氏杆菌重组BP26蛋白作为检测抗原,用棋盘滴定法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立间接ELISA方法,并进行验证。采用建立的间接ELISA方法与传统的试管凝集试验同时检测116份血清样品,评价二者的符合率。结果间接ELISA的最佳反应条件为:抗原包被量5μg/孔;待检血清稀释倍数1∶200,作用时间60min;酶标二抗作用时间60min;封闭液为5%BSA,作用时间45min。S/P值≥0.363者判为阳性,S/P值≤0.291者判为阴性,介于两者之间判为可疑。该方法精密性良好,特异性较强,敏感性较高,与传统的试管凝集试验检测结果的符合率为93.3%。结论已成功建立了检测牛布氏杆菌特异性抗体的间接ELISA方法,为布氏杆菌病的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。 展开更多
关键词 牛布氏杆菌 重组bp26蛋白 间接ELISA
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布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立 被引量:20
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作者 程婷婷 石峰 +6 位作者 陈创夫 王远志 张辉 李志强 鲁芝子 监通 马齐蔓 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第2期122-126,130,共6页
目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分... 目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性。结果以粒径为40nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高。试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。结论制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 bp26 OMP31 胶体金 免疫层析 金黄葡萄球菌A蛋白
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