目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因...目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3′-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3′-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3′-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称-NC)和过表达miR-34a(质粒名称-miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293-T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3′-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性。结果得到含PrLZ基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性。在miR-34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,miR-34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3′-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点。展开更多
文摘目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3′-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3′-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3′-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称-NC)和过表达miR-34a(质粒名称-miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293-T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3′-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性。结果得到含PrLZ基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性。在miR-34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,miR-34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3′-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点。
