目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌...目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.展开更多
目的探讨DNA聚合酶δ3（eukaryote DNA polymeraseδ3,POLD3）在胃腺癌（gastric adenocarcinoma,GA）中的表达情况及临床意义。方法收集进行了根治性切除的GA患者82例,并收集相应手术切除标本。通过免疫组织化学、蛋白印迹、体外细胞...目的探讨DNA聚合酶δ3（eukaryote DNA polymeraseδ3,POLD3）在胃腺癌（gastric adenocarcinoma,GA）中的表达情况及临床意义。方法收集进行了根治性切除的GA患者82例,并收集相应手术切除标本。通过免疫组织化学、蛋白印迹、体外细胞学、实时定量PCR等技术检测GA组织与细胞株中POLD3的表达,分析POLD3表达对GA增殖、分化及预后等的影响。结果 1与肿瘤旁组织相比,POLD3在GA肿瘤组织中的核酸及蛋白表达水平均明显下调（P〈0.01）,体外细胞学实验有类似结果;2低POLD3表达水平促进肿瘤去分化及增殖;3POLD3表达水平影响GA患者的预后,高表达和低表达对应的中位总体生存期分别为34个月和16个月（P〈0.01）,低POLD3表达者其总体死亡风险为高表达者的2.43倍（95%可信区间为1.25-4.71）。结论 POLD3在GA肿瘤中表达下调,这种下调与肿瘤的增殖、分化及预后相关。展开更多
目的探讨DNA聚合酶δ3(eukaryote DNA polymeraseδ3,POLD3)、p53在肝细胞癌(以下简称"肝癌",Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及临床意义。方法收集进行了根治性切除的HCC患者108例,并收集相应的手术切除标本。采用免...目的探讨DNA聚合酶δ3(eukaryote DNA polymeraseδ3,POLD3)、p53在肝细胞癌(以下简称"肝癌",Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及临床意义。方法收集进行了根治性切除的HCC患者108例,并收集相应的手术切除标本。采用免疫组化EnVision法分别检测肝癌组织及癌旁组织中POLD3、p53蛋白的表达;分析POLD3、p53在肝癌组织中的表达与临床病理参数之间的关系。结果 (1)POLD3、p53在肝癌组织中的表达率均高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.001)。(2)p53在肝癌中的表达与组织学分化有关(P<0.001),与其他指标无关(P>0.05)。(3)POLD3在肝癌中的表达与组织学分化有关(P<0.05),与其他指标无关(P>0.05)。(4)POLD3和p53在肝癌组织中的表达呈正相关性(r=0.276,P=0.004)。结论 (1)POLD3异常表达促进肝细胞癌的增殖、分化。(2)p53基因突变在某种程度上是导致POLD3在肝癌组织中高表达的原因之一。展开更多
文摘目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.
