PEDV、PoRV、PDCoV多重荧光定量RT-PCR方法的建立和应用 被引量：1

1

作者 陈登金 李鹏宇 +5 位作者 董楠 常昊天 胡渤 肖进 张蕾 马良 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第9期71-78,共8页

为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的同时鉴别检测,本试验根据PEDV核衣壳蛋白(N)基因、PoRV结构蛋白6(VP6)基因和PDCoV基质蛋白(M)基因筛选设计3对特异性引物和荧光标记探针,通过矩阵法优化... 为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的同时鉴别检测,本试验根据PEDV核衣壳蛋白(N)基因、PoRV结构蛋白6(VP6)基因和PDCoV基质蛋白(M)基因筛选设计3对特异性引物和荧光标记探针,通过矩阵法优化反应条件,建立多重荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,绘制标准曲线,验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并进行临床样本检测。标准曲线拟合试验结果显示,PEDV、PoRV和PDCoV多重荧光定量RT-PCR方法针对各病毒扩增均具有良好的相关系数和扩增效率;特异性试验结果显示,该方法仅对PEDV、PoRV和PDCoV呈现特异性扩增,不与其他猪源病毒发生交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对PEDV、PoRV和PDCoV的最低检测限均为1×10^(0)copies/μL;组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对367份临床样本进行PEDV、PoRV和PDCoV检测,多重荧光定量RT-PCR检测的阳性率为92.37%(339/367),而地方标准多重RT-PCR检测的阳性率为83.38%(306/367),2种方法临床样本检测符合率为91.01%(334/367)。结果表明,本试验建立了一种可快速、准确、灵敏检测PEDV、PoRV和PDCoV的多重荧光定量RT-PCR方法,可用于实验室病原和临床样本检测,为临床猪病毒性腹泻的研究和防控提供了有效技术方法。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪轮状病毒(porv) 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) 逆转录聚合酶链式反应

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PEDV、TGEV、PoRV 3种猪病毒性腹泻病毒的流行现状及控制策略 被引量：26

2

作者 王艳丰 张丁华 +2 位作者 李爱心 程征 刘守铉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第2期518-527,共10页

引起猪病毒性腹泻的病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(porcine rotarvirus,PoRV),临床均以呕吐、严重腹泻和脱水为特征... 引起猪病毒性腹泻的病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(porcine rotarvirus,PoRV),临床均以呕吐、严重腹泻和脱水为特征,哺乳仔猪发病率和病死率较高,后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻,发病率较低。特别是自2010年以来,PEDV变异毒株的流行已对全球的生猪产业造成严重影响,而已有的防控措施已经不能应对新的流行态势。近年来,针对PEDV、TGEV、PoRV的毒株流行变化及防控措施研究的较多,许多新技术、新方法已应用于3种病原的控制。作者基于当前3种病毒的遗传变异分析和流行现状,从饲养管理、免疫预防、中药疗法、干扰疗法、特异疗法及返饲疗法等方面对防控措施进行综述,以期为猪病毒性腹泻的防控提供科学依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 猪轮状病毒(porv) 流行现状 防控措施

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贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查 被引量：3

3

作者 丁尊俄 冯旭芳 +11 位作者 张双翔 何贤海 胡兴义 张海 王开功 文明 程振涛 李晨 蒲翠敏 罗引幸 刘丽娟 周碧君 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期2397-2402,共6页

为探明贵州省近几年引起猪病毒性腹泻两个主要病原PEDV与PoRV的变异情况,本研究对贵州省贵阳市、合肥市、安顺市、黔东南洲等5个地（州市）26个规模化养猪场采集了213份疑似腹泻的粪便样品,采用实验室建立的PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR... 为探明贵州省近几年引起猪病毒性腹泻两个主要病原PEDV与PoRV的变异情况,本研究对贵州省贵阳市、合肥市、安顺市、黔东南洲等5个地（州市）26个规模化养猪场采集了213份疑似腹泻的粪便样品,采用实验室建立的PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR检出PEDV阳性的病料12份和PoRV阳性病料4份。根据GenBank登录的PEDV和PoRV基因序列,分别设计PEDV M基因和PoRV VP7基因特异性引物,扩增目的基因、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示：成功克隆了12株PEDV M基因（681 bp）和4株PoRV的VP7基因（981 bp）,M基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分别在98.1%～100%和98.2%～100%之间,与国内外参考毒株核苷酸及氨基酸同源性分别在97.4%～100%和97.3%～100%之间;VP7基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分别为95.5%～99.7%和96.9%～99.7%,与国内外参考毒株核苷酸及氨基酸同源性分别为71.9%～95.1%和72.7%～99.1%。贵州省PEDV地方流行株与疫苗株CV777、Attenuated DR13亲缘关系较远,PoRV地方流行株与G4型毒株Gottfried、HeN4等属于同一群。结果表明,本研究从分子流行病学角度证实了贵州省PEDV和PoRV流行与变异情况,为贵州省PEDV和PoRV合理的防控措施提供参考依据。 展开更多

关键词 PEDV porv 基因序列 亲缘关系

原文传递

基于Taqman探针三重Real-Time RT-PCR检测PEDV、TGEV、PoRV方法的建立与应用 被引量：2

4

作者 李儒曙 苏惠龙 +4 位作者 蒋郁明 邓湘辉 黄铮 赵福振 罗宝正 《广东畜牧兽医科技》 2019年第5期41-44,52,共4页

为研究能够同时检测PEDV、TGEV、PoRV三种猪病毒性腹泻病原的方法,分别设计三套特异性的引物和探针,建立了基于Taqman探针的三重Real-Time RT-PCR检测方法,实验结果表明,该方法特异性好,灵敏度高,检测最低浓度为10 copies/μL数量级.应... 为研究能够同时检测PEDV、TGEV、PoRV三种猪病毒性腹泻病原的方法,分别设计三套特异性的引物和探针,建立了基于Taqman探针的三重Real-Time RT-PCR检测方法,实验结果表明,该方法特异性好,灵敏度高,检测最低浓度为10 copies/μL数量级.应用该方法对广东11个地市的44份猪腹泻样品进行检测,其中PEDV阳性率为100%,TGEV、PoRV阳性率为0,证明PEDV是引起广东地区猪病毒性腹泻的重要病原. 展开更多

关键词 三重Real-TimeRT-PCR PEDV TGEV porv

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PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：8

5

作者 苗艳 陈亮 +4 位作者 朱庆贺 李阳 兰世捷 徐馨 李丹 《动物医学进展》 北大核心 2020年第3期66-70,共5页

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一... 为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪轮状病毒 猪嵴病毒 多重RT-PCR

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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：4

6

作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页

【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) VP6蛋白 截短表达 间接ELISA

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G1P[7]型猪轮状病毒的分离鉴定及其全基因组分析

7

作者 王建新 马润超 +5 位作者 周金柱 卞贤宇 朱雪蛟 李昱辰 张雪寒 李彬 《南方农业学报》 北大核心 2025年第3期932-943,共12页

[目的]分离鉴定G1P[7]型猪轮状病毒(PoRV)并进行全基因组分析,为仔猪腹泻病防控及疫苗研发提供理论依据。[方法]腹泻仔猪粪便样本由南京农业大学动物医学院提供,对样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔... [目的]分离鉴定G1P[7]型猪轮状病毒(PoRV)并进行全基因组分析,为仔猪腹泻病防控及疫苗研发提供理论依据。[方法]腹泻仔猪粪便样本由南京农业大学动物医学院提供,对样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及PoRV PCR检测。向PCR检测结果为阳性的样本上清液中加入胰蛋白酶,随后接种到MA104细胞进行病毒分离和纯化。通过PCR检测、电镜观察、间接免疫荧光检测和RAN-PAGE检测鉴定毒株。通过绘制病毒增殖曲线和检测病毒对MA104、Vero、IPEC-J2、HT-29、HRT-18和Caco-2细胞的易感性探究毒株生物学特性。利用生物信息学软件分析分离毒株的11个基因与国内外各基因型轮状病毒的同源性并构建病毒全基因组系统发育树。[结果]粪便样本PCR检测结果显示,粪便样本中仅PoRV呈阳性。成功分离出1株PoRV,将该毒株命名为JSNJ2023,病毒在MA104细胞上能稳定增殖和传代,经3次克隆,筛选出适合的克隆株,在第3次克隆中,选择病毒滴度最高的克隆株进行扩大培养,最终成功获得高滴度的单克隆毒株。病毒颗粒呈明显的球形结构,具有清晰的双层衣壳特征,直径约70 nm。间接免疫荧光检测结果显示,JSNJ2023毒株能感染MA104细胞。RNA-PAGE检测结果显示,JSNJ2023毒株具有A群轮状病毒特征性的11条电泳图谱,排列方式为4∶2∶3∶2。病毒增殖曲线显示,接种病毒18 h后JSNJ2023毒株在MA104细胞中的病毒滴度达峰值,随着感染时间的延长,病毒滴度逐渐降低。JSNJ2023毒株对细胞的易感性依次为MA104、IPEC-J2、HRT-18、HT-29、Caco2和Vero细胞。基因同源性分析与系统发育树构建结果显示,JSNJ2023毒株属于猪A群G1P[7]型轮状病毒,其基因型为G1-P[7]-I5。[结论]成功分离获得PoRV JSNJ2023毒株,其属于A群G1P[7]型轮状病毒,基因型为G1-P[7]-I5。JSNJ2023毒株与人、猪及牛轮状病毒存在高度同源性,其进化过程中可能受到人轮状病毒、PoRV与牛轮状病毒的影响,发生了基因重组或交换,形成了独特的基因型(R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1)。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) 全基因组测序 遗传进化分析 基因重组

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猪轮状病毒VP6蛋白的真核表达及单克隆抗体制备和应用

8

作者 魏黄思梧 张兴艺 +5 位作者 黄校花 刘昌锦 武文杰 沈政乔 罗锋 邓舜洲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期2750-2761,共12页

【目的】制备抗猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6蛋白单克隆抗体,为PoRV检测方法的开发提供参考。【方法】以痘苗病毒启动子P28为VP6的启动子,以G3型PoRV核酸为模板扩增VP6基因,通过无缝克隆方法将VP6基因片段克隆至pSWE178质粒,... 【目的】制备抗猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6蛋白单克隆抗体,为PoRV检测方法的开发提供参考。【方法】以痘苗病毒启动子P28为VP6的启动子,以G3型PoRV核酸为模板扩增VP6基因,通过无缝克隆方法将VP6基因片段克隆至pSWE178质粒,构建重组质粒pSWE178-P28-VP6;利用同源重组和蚀斑纯化技术获得表达VP6蛋白的重组猪痘病毒rSWE178-P28-VP6,用SDS-PAGE鉴定VP6蛋白表达形式。以G9型PoRV为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,以重组病毒表达的VP6蛋白为检测抗原,通过间接ELISA筛选分泌抗VP6单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测单克隆抗体与G3、G4、G5、G9型PoRV的反应原性,选择其中1株单克隆抗体对人工感染PoRV的猪肠道组织进行免疫组化(IHC)检测。【结果】在构建了表达PoRV VP6蛋白的重组质粒pSWE178-P28-VP6基础上,成功构建了表达PoRV VP6蛋白的重组猪痘病毒,表达的蛋白分子质量大小45 ku,为可溶性表达。采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,筛选获得29株分泌抗VP6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,26株单克隆抗体均能与G3、G4、G5、G9型PoRV反应,但荧光亮度存在差异。IHC检测结果显示,单克隆抗体能与感染PoRV的临床样品发生特异性免疫反应。【结论】本研究利用真核表达系统成功表达了PoRV VP6蛋白,采用杂交瘤技术筛选获得29株抗VP6单抗隆抗体,其中26株均能与G3、G4、G5、G9型PoRV反应。试验结果为PoRV免疫学检测方法的建立奠定了基础。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) VP6蛋白 真核表达 单克隆抗体

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一例猪轮状病毒性腹泻的诊断与防控

9

作者 陈锦成 孙守湖 贺东生 《猪业科学》 2025年第5期71-72,共2页

0前言轮状病毒(Rotavirus,RV)是经口传播的致病微生物,可感染人类和多种动物,导致肠道疾病。猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)对猪群中的危害尤其严重,特别是对幼龄个体,主要侵犯小肠上皮组织,引发腹泻症状。在生猪养殖业中,PoRV对... 0前言轮状病毒(Rotavirus,RV)是经口传播的致病微生物,可感染人类和多种动物,导致肠道疾病。猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)对猪群中的危害尤其严重,特别是对幼龄个体,主要侵犯小肠上皮组织,引发腹泻症状。在生猪养殖业中,PoRV对环境抵抗力强,在粪污中不易失活,传播能力强,加之基因不断重组并可能引起跨物种传播。 展开更多

关键词 腹泻 小肠上皮组织 轮状病毒 生猪养殖业 porv

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福州市闽侯县某规模化猪场轮状病毒病的诊治

10

作者 张金城 《猪业科学》 2025年第3期100-102,共3页

A群轮状病毒(Group A porcinerotavirus,RVA)是对世界各地的养殖业构成的严重威胁,与仔猪严重腹泻有关。病毒通过粪口途径传播,主要感染和破坏小肠成熟的肠细胞和肠内分泌细胞,导致急性胃肠炎。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)于197... A群轮状病毒(Group A porcinerotavirus,RVA)是对世界各地的养殖业构成的严重威胁,与仔猪严重腹泻有关。病毒通过粪口途径传播,主要感染和破坏小肠成熟的肠细胞和肠内分泌细胞,导致急性胃肠炎。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)于1976年首次从受感染的猪中分离出来。随后,许多研究记录了PoRV感染在世界各地的广泛流行。PoRV自被发现以来,已经给全球养猪业造成了巨大的经济损失。PoRV是一种双股正链RNA(dsRNA)病毒,属于呼肠孤病毒科的成员。 展开更多

关键词 腹泻 肠细胞 轮状病毒 粪口途径 仔猪 porv

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槲皮素缓减T-2毒素对细胞中猪轮状病毒复制的影响

11

作者 孙彤 高美晨 林洪金 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第3期403-414,共12页

为了探究槲皮素和/或T-2毒素在体外对猪轮状病毒(PoRV)复制的影响,检测PoRV在非洲绿猴肾细胞(MA104细胞)内的复制水平以及添加槲皮素和/或T-2毒素后对细胞氧化应激、自噬水平和PI3K/AKT通路表达指标的影响。结果表明,添加T-2毒素可提高P... 为了探究槲皮素和/或T-2毒素在体外对猪轮状病毒(PoRV)复制的影响,检测PoRV在非洲绿猴肾细胞(MA104细胞)内的复制水平以及添加槲皮素和/或T-2毒素后对细胞氧化应激、自噬水平和PI3K/AKT通路表达指标的影响。结果表明,添加T-2毒素可提高PoRV在细胞内复制水平;染色结果显示,添加槲皮素后PoRV+Que组与对照组相比,细胞内氧化应激和自噬水平显著上升,但与T-2+PoRV组和T-2+PoRV+Que组相比,氧化应激和自噬水平均有所缓解,病毒复制水平显著降低;PoRV、自噬相关基因和通路的mRNA和蛋白表达水平的检测结果表明,T-2毒素处理后,细胞氧化应激水平、自噬水平、病毒复制水平均上升;经槲皮素处理后,细胞内氧化应激水平、自噬基因表达水平、病毒复制水平相对下降。结论:槲皮素能缓减T-2毒素对细胞内病毒复制、氧化应激和自噬水平的影响。 展开更多

关键词 T-2毒素 猪轮状病毒 槲皮素 氧化应激 自噬

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植物乳杆菌胞外囊泡的分离纯化及抑制猪轮状病毒复制的效果评价

12

作者 张仕涵 孙安琪 +6 位作者 单心 屈广隆 汤正旭 仉鑫悦 刘紫璇 王一冰 胡静涛 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第8期1041-1049,共9页

为阐明植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,LP)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)对猪轮状病毒(PoRV)增殖复制的抑制作用。本研究采用超滤浓缩联合超高速离心的方法分离纯化植物乳杆菌EVs,通过透射电镜、纳米粒径分析、BCA... 为阐明植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,LP)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)对猪轮状病毒(PoRV)增殖复制的抑制作用。本研究采用超滤浓缩联合超高速离心的方法分离纯化植物乳杆菌EVs,通过透射电镜、纳米粒径分析、BCA蛋白定量、SDS-PAGE和琼脂糖核酸电泳等方法对胞外囊泡的形态、粒径大小、蛋白和核酸进行鉴定分析。同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究对象,通过EVs与IPEC-J2共作用,检测IFN-β的转录和表达,明确EVs对IPEC-J2抗病毒功能的影响。感染PoRV后,通过TCID50检测病毒滴度,RT-q PCR检测PoRV NSP4基因转录,以明确EVs对PoRV在IPEC-J2细胞中增殖复制的影响。结果显示,成功获得植物乳杆菌EVs,透射电镜显示EVs呈球状小泡结构,粒径直径平均约为132.5 nm,蛋白浓度为2.5 mg/m L,DNA含量为238.35μg/m L,RNA含量为258.8μg/m L。EVs与IPEC-J2共培养12 h能显著促进IFN-β的转录和表达,抑制PoRV在IPEC-J2细胞中的增殖。本研究结果为探索乳酸菌调控宿主固有免疫发挥抗病毒作用机制提供了理论依据。 展开更多

关键词 植物乳杆菌 胞外囊泡 IFN-Β 猪轮状病毒

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猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用 被引量：3

13

作者 李妍花 周兵强 +11 位作者 康笃利 郝丽影 汪志艳 赵少若 黄甜 庞杏豪 刘俊阳 楚园园 张云静 高晓静 邓均华 田克恭 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1223-1231,共9页

【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测... 【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测线和质控线。通过优化胶体金溶液最适pH、标记抗体和检测抗体的最佳使用量,制备PoRV胶体金检测试纸条;对试纸条的灵敏度、敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评价。通过检测50份猪粪便样品,计算试纸条与RT-PCR方法的符合率,最后采用试纸条进行1249份临床样品的测定。【结果】经优化后试纸条的最佳参数如下:胶体金溶液最佳pH为8.0,标记抗体4G5和检测抗体5G4最佳使用量分别为14.4μg/mL和1 mg/mL。试纸条能检测出1∶2000稀释的PoRV OSU株(G5型)病毒液,灵敏度为104.5TCID50/mL,且检测PoRV G9、G3和G4型毒株均为阳性。检测猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)均为阴性。批内和批间重复性、稳定性良好。检测50份猪粪便样品,与RT-PCR方法的阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总体符合率为98%(49/50)。检测2022年在河南、山西省猪场收集的临床样品1249份,阳性检出率为5.2%。【结论】本研究制备的PoRV胶体金检测试纸条具有良好的敏感性、特异性和重复性等优点,与RT-PCR方法的符合率较高,可用于规模化猪场PoRV的快速检测。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) 胶体金检测试纸条 快速检测

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猪轮状病毒疫苗研究进展 被引量：3

14

作者 陈少聪 吴允昆 《现代畜牧兽医》 2024年第7期75-79,共5页

猪轮状病毒(PoRV)是导致仔猪患病毒性腹泻的主要病原体之一,可对养猪业造成巨大的经济损失。目前,疫苗接种被认为是防治PoRV感染最有效的手段。为了更好地预防和控制PoRV感染,文章总结了目前用于防控PoRV感染的不同类型疫苗,包括灭活疫... 猪轮状病毒(PoRV)是导致仔猪患病毒性腹泻的主要病原体之一,可对养猪业造成巨大的经济损失。目前,疫苗接种被认为是防治PoRV感染最有效的手段。为了更好地预防和控制PoRV感染,文章总结了目前用于防控PoRV感染的不同类型疫苗,包括灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗,并对其应用研究进展进行了综合评述,通过分析各类疫苗的优缺点以及治疗效果,以期为未来PoRV疫苗的研发提供参考。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) 病毒性腹泻 病毒感染 新疫苗研发

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猪轮状病毒主要非结构蛋白的原核表达、抗体制备及应用 被引量：2

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作者 卞贤宇 李素芬 +9 位作者 王建新 韩楠 卢洪婷 程曦 周金柱 陶然 朱雪蛟 董海龙 张雪寒 李彬 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2024年第17期3494-3506,共13页

【背景】轮状病毒(Rotavirus,RV)是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一,在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)引起的一种急性肠道传染病,常造成仔猪消化道功能紊乱... 【背景】轮状病毒(Rotavirus,RV)是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一,在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)引起的一种急性肠道传染病,常造成仔猪消化道功能紊乱,引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状,一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前,针对PoRV感染尚无特效药物治疗,疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而,PoRV基因型多且易变异,不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此,亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究,探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体,为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后,克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后,采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔,每隔14 d加强免疫一次,经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光(IFA)和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达,以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白,SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带,并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体,ELISA效价均超过1﹕81000,表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应,与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达,但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达,这一结果可能与NSP2的表达特性有关,有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白,并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体,为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。 展开更多

关键词 猪轮状病毒 非结构蛋白 原核表达 多克隆抗体

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一例猪流行性腹泻病毒和轮状病毒混合感染的诊断及基因型分析

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作者 袁章 李祥 +2 位作者 赖毅 严明奎 贾静 《四川畜牧兽医》 2024年第12期30-33,共4页

为确诊南充某猪场仔猪腹泻的发病原因,对发病仔猪的肠组织及内容物进行细菌分离鉴定及常见病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR检测,并对核酸阳性病原的部分基因序列进行测序与基因型分析。结果表明,该腹泻样品中未分离出致病细菌,荧光定量PCR... 为确诊南充某猪场仔猪腹泻的发病原因,对发病仔猪的肠组织及内容物进行细菌分离鉴定及常见病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR检测,并对核酸阳性病原的部分基因序列进行测序与基因型分析。结果表明,该腹泻样品中未分离出致病细菌,荧光定量PCR检测PEDV和PoRV核酸呈阳性,对PEDV S基因和PoRV VP7基因序列进行扩增测序及遗传进化分析,显示该PEDV毒株属于G2d型,与四川毒株CH-SC-YM-2018的同源性最高,PoRV毒株属于G9型,与北京毒株CHN/GX/TL6/2022/G的同源性最高。综合分析得出,该场仔猪腹泻是由G2d型PEDV和G9型PoRV混合感染所致。 展开更多

关键词 PEDV porv 混合感染 实验室诊断 基因分型

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猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律 被引量：9

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作者 杨文宇 朱玲 +2 位作者 周远成 郭万柱 徐志文 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期192-198,共7页

为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律，本试验利用MARC-145细胞，从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV，并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实，命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株... 为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律，本试验利用MARC-145细胞，从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV，并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实，命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后，分别收集病毒液进行定量分析；同时，以SC-R分离株感染MARC-145细胞，在感染后不同时间分别收集感染病毒液，利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析，绘制PoRV生长曲线。结果表明，用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组；-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长，感染后0～8h为潜伏期，病毒RNA含量维持在较低水平；8～36h为突破期，病毒RNA含量呈对数增长；感染48h增长速度减缓，维持在较高水平，逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性，3％是本试验最为适用的胰酶浓度；PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) 生长曲线 TCID50 胰酶

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猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定 被引量：18

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作者 刘小兰 刘昌锦 +5 位作者 余文洋 李潇翔 边彦超 黄校花 罗锋 邓舜洲 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第8期3151-3162,共12页

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine ... 【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15μg/mL的胰酶处理37℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) 分离鉴定 动物回归试验

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新疆伊犁河谷地区规模化猪场病毒性腹泻疾病检测与分析 被引量：4

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作者 王传锋 米青婕 皮志媛 《中国猪业》 2022年第2期70-73,共4页

为了解2021年伊犁河谷地区规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒性腹泻的感染情况,试验采用RT-PCR对2021年从伊犁河谷地区规模... 为了解2021年伊犁河谷地区规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒性腹泻的感染情况,试验采用RT-PCR对2021年从伊犁河谷地区规模化猪场采集患腹泻病猪的血液、粪便及肠内容物等1200份病料组织检测5种病毒性疾病的感染情况。结果表明,PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV总阳性率分别为34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%,以PEDV和PoRV阳性率较高,且以二重感染为主,其中PEDV/TGEV、PEDV/PoRV二重感染率分别为7.2%、9.4%,试验为该地区猪场中5种病毒性腹泻疾病的防控提供参考依据。 展开更多

关键词 猪 腹泻 PEDV TGEV porv PDCoV BVDV

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猪轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用 被引量：5

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作者 胡兴义 张双翔 +5 位作者 冯旭芳 周碧君 文明 程振涛 王伟 王开功 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期740-746,共7页

为了建立一种适用于猪轮状病毒(PoRV)的逆转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)的快速、灵敏检测方法。依据GenBank上登录的PoRV VP7基因保守序列,设计了6条特异性引物,通过对外引物与内引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓... 为了建立一种适用于猪轮状病毒(PoRV)的逆转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)的快速、灵敏检测方法。依据GenBank上登录的PoRV VP7基因保守序列,设计了6条特异性引物,通过对外引物与内引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和反应条件等进行优化。结果显示,当外引物与内引物浓度比为200nmol/L∶2 400nmol/L(1∶12)、Bst DNA聚合酶浓度为0.64 U/μL、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、dNTP浓度为1.0mmol/L,在恒温(60℃)条件下作用60min,扩增效果出现明显"梯状"条带,同时对建立的RT-LAMP检测方法进行特异性和敏感性验证,其只有PoRV获得特异性扩增条带,与其他猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒等无交叉反应,具有良好的特异性,最低检测分子拷贝数为1.0×102拷贝/μL,具有极高的敏感性。反应结束后肉眼可见阳性扩增产物出现白色沉淀,加入SYBR GreenⅠ观察颜色变化可以判定结果。该方法适用于野外、基层部门和海关快速检测PoRV的新方法,在临床上有良好的推广意义。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(porv) RT-LAMP 建立 应用

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