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基于CRISPR∕Cas9技术创制抗稻瘟病基因pi21突变体
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作者 谢留杰 段敏 黄善军 《上海农业学报》 2025年第2期8-15,共8页
利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株... 利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株中检测出6个不含载体的纯合突变体,包含3种突变类型,分别命名为pi21-t1、pi21-t2、pi21-t3,每种突变分别导致pi21基因编码的蛋白缺失227、239、99个氨基酸。稻瘟病鉴定结果表明:成熟期时,3种突变体中仅pi21-t3的病斑数量和面积较台15-7糯显著降低,其他2种突变体发病水平与台15-7糯基本相同。除抗稻瘟病能力有所提高外,突变体pi21-t3在成熟期的其他农艺性状,如株高、每穗粒数、结实率等,与台15-7糯没有显著差异。本研究可为抗稻瘟病水稻育种提供借鉴。 展开更多
关键词 CRISPR∕Cas9技术 pi21基因 稻瘟病 纯合突变体
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利用CRISPR/Cas9系统编辑Pi21基因改良‘大粒香’稻瘟病抗性
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作者 彭强 李佳丽 +3 位作者 徐海峰 张习春 张大双 朱速松 《分子植物育种》 北大核心 2025年第17期5734-5739,共6页
稻瘟病严重危害水稻产量,抗稻瘟病成为水稻新品种选育和大规模生产应用的前提。功能缺失的Pi21基因具有稻瘟病抗性,为改良优质稻‘大粒香’的稻瘟病抗性,本研究对Pi21基因进行定向基因编辑。利用CRISPR/Cas9系统,Pi21基因作为编辑靶基因... 稻瘟病严重危害水稻产量,抗稻瘟病成为水稻新品种选育和大规模生产应用的前提。功能缺失的Pi21基因具有稻瘟病抗性,为改良优质稻‘大粒香’的稻瘟病抗性,本研究对Pi21基因进行定向基因编辑。利用CRISPR/Cas9系统,Pi21基因作为编辑靶基因,构建基因编辑载体CRISPR-Pi21,通过农杆菌介导方法转化优质稻‘大粒香’愈伤组织。创建16份发生Pi21基因编辑事件的CRISPR-Pi21材料,获得了不含Cas9外源的Pi21纯合突变植株。与表现为高感(综合指数为9.0)的对照‘大粒香’相比,2份改良株系的叶瘟和穗瘟抗级显著降低,其稻瘟病抗性评价为中感(综合指数为4.5)。利用CRISPR/Cas9系统能有效地编辑目标基因Pi21,提高改良株系的稻瘟病抗性,在水稻生物育种领域具有应用价值。 展开更多
关键词 稻瘟病 pi21 基因编辑 遗传转化
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利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析 被引量:23
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作者 王芳权 范方军 +4 位作者 李文奇 朱金燕 王军 仲维功 杨杰 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期469-478,共10页
利用CRISPR/Cas9技术,针对Pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2... 利用CRISPR/Cas9技术,针对Pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2同时突变的效率为78.57%,突变效率较高。通过对靶位点进行测序,发现靶位点突变类型较多,包括碱基缺失、碱基插入、碱基缺失后插入其他碱基和大片段DNA缺失等类型。对突变株系进行氨基酸预测,发现大部分株系都存在移码突变现象而使基因突变彻底,少数株系表现为部分氨基酸的缺失或变异。成功敲除了水稻Pi21基因,并对突变效率和类型进行了分析,为进一步验证Pi21基因功能、培育广谱抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 稻瘟病 pi21 基因敲除
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基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定 被引量:17
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作者 杨海河 毕冬玲 +6 位作者 张玉 邹小维 高晓庆 袁正杰 曲海艳 何海燕 瞿绍洪 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期4451-4465,共15页
利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-... 利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-DNA的T1植株,从23个T1株系筛选获得107个不含T-DNA转基因序列的植株。然后对pi21的编辑位点进行酶切和测序分析,获得了21株pi21纯合突变体。对1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种,与未转化日本晴相比,突变株系显著抗病。对接种水稻样品的6个病程相关基因进行q RT-PCR分析,与感病日本晴比较,pi21突变株系在接种稻瘟病菌后,病程相关基因诱导表达的速度更快,表达量更高。本研究利用基因编辑技术,实现了对感稻瘟病水稻的定点突变并提高了其稻瘟病抗性水平,为利用该技术培育持久抗稻瘟病水稻品种奠定了研究基础。 展开更多
关键词 pi21 CRISPR/Cas9 水稻稻瘟病抗性 病程相关基因 QRT-PCR
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Marker-Assisted Introgression of Quantitative Resistance Gene pi21 Confers Broad Spectrum Resistance to Rice Blast 被引量:1
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作者 Rosalyn B.ANGELES-SHIM Vincent P.REYES +6 位作者 Marilyn Mdel VALLE Ruby S.LAPIS Junghyun SHIM Hidehiko SUNOHARA Kshirod K.JENA Motoyuki ASHIKARI Kazuyuki DOI 《Rice science》 SCIE CSCD 2020年第2期113-123,共11页
The quantitative resistance gene pi21 from Sensho was introgressed to an indica breeding line IR63307-4B-13-2,a pyramiding line IRBB4/5/13/21,and a tropical japonica line Kinandang Patong by marker-assisted backcrossi... The quantitative resistance gene pi21 from Sensho was introgressed to an indica breeding line IR63307-4B-13-2,a pyramiding line IRBB4/5/13/21,and a tropical japonica line Kinandang Patong by marker-assisted backcrossing.A total of 192 improved lines at the BC4F3 and BC4F4 generations were developed and confirmed to have the gene introgression via genotyping using a pi21-specific InDel marker.Thirteen randomly selected improved lines,representing all the three genetic backgrounds,demonstrated resistance against leaf blast composites in the field and a broader spectrum resistance against individual isolates compared to the recurrent parents in the glasshouse.Specifically,the tested lines exhibited pi21-acquired resistance against 11 leaf blast isolates that elicited susceptible reactions from the recurrent parents.All the tested lines maintained a comparative heading date,and similar or improved panicle length,number of primary branches per panicle and number of total grains per panicle relative to the recurrent parents.The physical grain characteristics of the recurrent parents were also maintained in the 13 lines tested,although variability in the amylose content and chalkiness degree was observed.The successful marker-assisted introgression of pi21 in diverse genetic backgrounds and the resulting broader spectrum resistance of improved lines against leaf blast indicate the potential of pi21 for deployment in cultivars grown across other rice growing regions in Asia. 展开更多
关键词 rice BLAST pi21 gene marker-assisted BREEDING disease RESISTANCE
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利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性 被引量:31
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作者 徐鹏 王宏 +5 位作者 涂燃冉 刘群恩 吴玮勋 傅秀民 曹立勇 沈希宏 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期313-322,共10页
[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 ... [目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。 展开更多
关键词 水稻 CRISPR/Cas9 Pita pi21 ERF922 稻瘟病抗性
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利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系 被引量:12
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作者 梁敏敏 张华丽 +4 位作者 陈俊宇 戴冬青 杜成兴 王惠梅 马良勇 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期248-258,共11页
【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系,为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点,构建多基因表达载体pC1300-2×35S:... 【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系,为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点,构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^(TMS5)-g^(Badh2)-g^(Pi21),转化优质常规籼稻品种中早70,测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定,利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量进行测定。【结果】在T_(0)转基因株系中,Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%,突变类型多为双等位突变。从T_(1)代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系,获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明,与野生型相比,T_(2)代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调,ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性,TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低,高温下Ub_(L40)4基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比,在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调,并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑,获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系,为高抗、香型不育系材料的选育提供参考,加快高产优质杂交水稻的选育。 展开更多
关键词 水稻 CRISPR/Cas9 Badh2 pi21 TMS5
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芪玉三龙方干扰miRNA21/PTEN/PI3K信号轴抑制LLC肺癌细胞增殖 被引量:4
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作者 张星星 高雅婷 +4 位作者 王小乐 杨勤军 刘桐 童佳兵 李泽庚 《中华中医药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期126-130,共5页
目的:探讨芪玉三龙方抑制LLC肺癌细胞增殖的分子机制。方法:LLC肺癌细胞常规传代培养,分别设置为LLC组、空白血清组、siRNA组、含药血清组。MTT法筛选芪玉三龙方最佳作用浓度和作用时间。RT-qPCR、Western Blot及免疫荧光法检测miRNA21/... 目的:探讨芪玉三龙方抑制LLC肺癌细胞增殖的分子机制。方法:LLC肺癌细胞常规传代培养,分别设置为LLC组、空白血清组、siRNA组、含药血清组。MTT法筛选芪玉三龙方最佳作用浓度和作用时间。RT-qPCR、Western Blot及免疫荧光法检测miRNA21/PTEN/PI3K信号轴相关分子表达。结果:芪玉三龙方含药血清呈浓度依赖性抑制LLC肺癌细胞活性。与LLC组比较,siRNA组和含药血清组miRNA21 mRNA表达显著降低(P<0.01),PTEN蛋白和mRNA表达显著上升(P<0.01),p-AKT、p-mTOR、eIF4E、p70S6K蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),含药血清组PI3K蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:芪玉三龙方可抑制miRNA21的转录,使PTEN表达有所上升,下调PI3K/AKT/mTOR信号轴关键分子表达,从而温和抑制LLC肺癌细胞增殖。 展开更多
关键词 芪玉三龙方 LLC肺癌细胞 miRNA21/PTEN/PI3K信号轴 细胞增殖
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化浊颗粒对2型糖尿病大鼠肝组织微小RNA-21/PTEN/PI3K/AKT信号通路的调控作用 被引量:6
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作者 余臣祖 张朝宁 +1 位作者 张小娟 安小平 《世界中西医结合杂志》 2022年第4期721-724,共4页
目的观察化浊颗粒对2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肝组织微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)/磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/PI3K/AKT信号通路的调控作用。方法将40只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、... 目的观察化浊颗粒对2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肝组织微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)/磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/PI3K/AKT信号通路的调控作用。方法将40只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、中药组、罗格列酮组。除正常对照组外,其余组别采用高糖、高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM大鼠模型。造模后中药组及罗格列酮组分别以化浊颗粒和罗格列酮灌胃,模型组与正常对照组给予生理盐水灌胃。连续灌胃10周后处死各组大鼠,Q-PCR检测大鼠肝组织中miR-21、PTEN、PI3K、AKT mRNA水平,Western blot检测大鼠肝组织PTEN、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果与正常对照组比较,模型组PTEN蛋白及mRNA表达下调,miR-21、PI3K、AKT mRNA表达水平升高,PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药组及罗格列酮组大鼠肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达上调,miR-21、PI3K、AKT mRNA表达水平降低,PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论T2DM大鼠肝组织中miR-21及其靶基因PTEN调控的PI3K/AKT信号通路表达异常,化浊颗粒通过下调miR-21、上调PTEN表达,进而抑制PI3K/AKT信号通路、改善胰岛素抵抗,发挥治疗T2DM的作用。 展开更多
关键词 2型糖尿病 化浊颗粒 microRNA-21/PTEN/PI3K/AKT信号通路
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FGF21作为运动因子在有氧运动抑制心梗心肌细胞凋亡中的作用及其机制探讨 被引量:12
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作者 田振军 李明晓 XI Lei 《体育科学》 CSSCI 北大核心 2018年第12期35-44,67,共11页
目的:探讨成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)在有氧运动抑制心肌梗死(myocardialinfarction,MI)大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠40只,体重180~220g,心梗模型采用左冠状动脉前... 目的:探讨成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)在有氧运动抑制心肌梗死(myocardialinfarction,MI)大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠40只,体重180~220g,心梗模型采用左冠状动脉前降支永久性结扎的方法,术后随机分为假手术组(S组)、心梗安静组(MI组)和心梗+有氧运动组(ME组),S组只穿线不结扎。ME组在术后1周进行4周跑台训练。训练后次日腹腔麻醉,测定LVSP、LVEDP和±dp/dtmax评价心功能。培养H9C2大鼠心肌细胞并采用浓度为400μmol/L的H2O2刺激4h构建心肌细胞凋亡模型,采用AMPK激动剂AICAR和FGF21受体FGFR1抑制剂PD166866干预H9C2大鼠心肌细胞。Masson染色观察分析心肌胶原容积分数(collagenvolumefraction,CVF%)。Western blotting检测心肌FGF21、FGFR1、Bax、Bcl-2的蛋白表达及PI3K-Akt通路蛋白的表达,RTqPCR测定心肌FGF21和FGFR1的表达,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况。结果:与S组比较,MI组心肌FGF21、FGFR1、Bax/Bcl-2以及PI3K、Akt蛋白表达显著升高,FGF21和FGFR1表达显著升高,TUNEL阳性颗粒显著增加,胶原纤维百分比升高,心功能下降;与MI组比较,ME组心肌FGF21、FGFR1以及PI3K、Akt蛋白表达进一步升高,Bax/Bcl-2显著下降,TUNEL阳性颗粒显著减少,胶原纤维百分比下降,心功能改善;且心肌FGF21表达与抑制心肌细胞凋亡和心功能改善呈显著正相关。PD166866干预H9C2大鼠心肌细胞Bax/Bcl-2表达显著升高,TUNEL阳性颗粒显著增加,炎性因子TNF-α/IL-10显著升高,PI3K-Akt蛋白表达显著下降;AMPK激动剂AICAR单一干预或与FGF21受体抑制剂PD166866二者联合干预均可显著逆转此不利影响。结论:有氧运动可显著上调心梗大鼠心肌FGF21/FGFR1的表达,其机制是通过激活下游PI3K-Akt信号通路,降低心梗心脏炎症反应,进而抑制心肌细胞凋亡。表明,FGF21/FGFR1/PI3K-Akt信号通路在有氧运动抑制心肌细胞凋亡、降低心肌胶原纤维化面积扩增和改善心功能方面发挥重要作用。 展开更多
关键词 有氧运动 心肌梗死 FGF21/FGFR1/PI3K-Akt信号通路 心肌细胞凋亡
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基于miR21/PI3K-Akt/SREBP通路研究泽泻汤对高脂血症模型小鼠的调脂作用机制 被引量:7
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作者 鞠爱霞 孙爽 +5 位作者 王瑞楠 韩宇博 周育生 陈晶 刘莉 李秋红 《南京中医药大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期917-931,共15页
目的 探索经典名方泽泻汤对高脂血症模型小鼠的调脂作用机制。方法 采用ELISA法检测血清中血脂四项、肝功能指标及胆固醇脂酰转移酶(LCAT)水平。采用HE和油红O染色法判断肝组织病理情况。采用网络药理学预测泽泻汤降脂相关靶点,实现对... 目的 探索经典名方泽泻汤对高脂血症模型小鼠的调脂作用机制。方法 采用ELISA法检测血清中血脂四项、肝功能指标及胆固醇脂酰转移酶(LCAT)水平。采用HE和油红O染色法判断肝组织病理情况。采用网络药理学预测泽泻汤降脂相关靶点,实现对交集靶点GO功能和KEGG通路富集分析。采用PCR芯片技术检测网络药理学筛选的目的基因,应用qPCR和Western blot检测基因和蛋白表达量。结果 泽泻汤可显著调节高脂血症模型小鼠的血脂四项水平,改善因高脂引起的肝损伤指标升高,对肝脏组织中脂质代谢关键酶HMGR、CYP7A1及脂质转运体ABCA1、Apo-A1具有反向调节作用。HE和油红O染色显示,泽泻汤可改善肝组织病理形态,减轻肝组织的脂质沉积情况,阳性面积比率显著下降(P<0.01)。PCR芯片获取反向调节基因44个,GO功能富集分析获取了266个条目,KEGG通路富集分析筛选得到99条信号通路。qPCR及Western blot结果显示,泽泻汤组显著下调PIK3CG、AKT1、IL-6基因表达量(P<0.05,P<0.01),上调ABCG1基因表达量(P<0.05),下调PI3 Kinase p110β、p-AKT(Ser473)及SREBP-1c蛋白表达水平(P<0.01);泽泻汤能够反向调节miR21-5p(P<0.01)。结论 泽泻汤对高脂血症模型小鼠脂代谢具有显著的调节作用,能改善高脂血症引起的肝损伤,其调脂作用可能与调节胆固醇在体内代谢、转运有关,与miR21/PI3K-Akt/SREBP通路密切相关,且泽泻汤全方调脂效果优于单味药。 展开更多
关键词 泽泻汤 miR21/PI3K-Akt/SREBP通路 高脂血症
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