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猪圆环病毒3型LAMP-PfAgo检测方法的建立
1
作者 祁钊 余相宇 +1 位作者 陈魏圆 宋祥军 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期1-9,31,共10页
【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守... 【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1~PCV3-T4等4组引物(每组包括1对内引物和1对外引物),以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组,并对LAMP反应的Mg ^(2+)浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列,设计PCV3-gs1~PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针,进行LAMP-PfAgo反应,筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、gDNAs浓度、Mn 2+浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价;并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测,比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列,表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg ^(2+)终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增,并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn 2+终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示,LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法,该方法灵敏度高和特异性强,具有潜在的临床应用价值。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 pfago 环介导等温扩增 即时检验 猪
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基于PfAgo技术的猪细小病毒快速检测方法的建立
2
作者 吴崇铤 苟婧萱 +5 位作者 兰守信 张曼琪 涂健 王振宇 邵颖 宋祥军 《安徽农业大学学报》 CSCD 2024年第6期1013-1021,共9页
为了将优化的PfAgo荧光法与环介导等温扩散(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立灵敏、快速、特异的猪细小病毒(porcine pavovirus,PPV)检测方法,针对PPV保守序列VP2分别筛选gDNA并设计对应的分子信标,初步建... 为了将优化的PfAgo荧光法与环介导等温扩散(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立灵敏、快速、特异的猪细小病毒(porcine pavovirus,PPV)检测方法,针对PPV保守序列VP2分别筛选gDNA并设计对应的分子信标,初步建立基于PfAgo的荧光检测法,在同靶位筛选LAMP的引物并对其扩增条件进行优化,将两者结合探究其敏感性和特异性,最后使用优化后的方法对临床样本进行检测。结果表明PfAgo荧光检测法最佳反应温度为95℃,最佳引物使用量为750 pmol,分子信标最佳使用量为15 pmol,最佳反应时间为30 min,PfAgo荧光检测法具有高度的专一性。LAMP检测法筛选出最佳扩增温度为61℃,最适反应时间为40 min,dNTP最佳终浓度为1.2 mmol·L^(-1),锰离子最佳终浓度为10 mmol·L^(-1),最适内外引物比例为4∶1,其灵敏度可达101 copies·µL^(-1),与其他检测样本无交叉反应、特异性良好。将LAMP和PfAgo荧光检测法相结合后,其灵敏度可达101 copies·µL^(-1),特异性试验结果表明该方法专一性强。研究建立的PPV-LAMP-PfAgo荧光法,灵敏性高、特异性强,具备灵敏、快速等优点,为临床基层检测PPV提供一种新的技术手段。 展开更多
关键词 pfago 猪细小病毒 环介导等温扩增 快速检测
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基于PfAgo的生物传感器在病原微生物检测中的研究进展
3
作者 李广大 王敬夫 +2 位作者 石晋 田磊 丁明超 《中华口腔医学研究杂志(电子版)》 2025年第2期124-131,共8页
病原微生物检测是临床感染疾病诊断的常用方法,其高效精准的检测在明确病因和诊断治疗方面尤为重要。随着生物技术和传感器技术的不断发展,智能化和便携化的生物传感器在微生物检测等方面为人类健康作出巨大贡献。目前,学者们发现了一... 病原微生物检测是临床感染疾病诊断的常用方法,其高效精准的检测在明确病因和诊断治疗方面尤为重要。随着生物技术和传感器技术的不断发展,智能化和便携化的生物传感器在微生物检测等方面为人类健康作出巨大贡献。目前,学者们发现了一种来源于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的Argonaute(Ago)蛋白PfAgo,在病原微生物检测方面应用广泛。相较于传统微生物检测技术,PfAgo酶优势突出,适用于各种复杂环境下的病原微生物快速精准检测。本文简要介绍了PfAgo酶的发展、原理及优势,阐述了基于PfAgo酶的生物传感器在病原微生物检测等方面的应用案例。综合分析,基于PfAgo酶的生物传感器检测技术具有操作简便、试剂消耗少、检测速度快、假阳性率低和自动化程度高等优势,针对病原微生物检测等方面有着十分广阔的发展空间和应用前景。 展开更多
关键词 pfago酶 生物传感器 病原微生物 微生物检测
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