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小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的表达与ELISA检测方法的建立 被引量:8
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作者 张喜悦 王志亮 +6 位作者 刘春菊 李林 包静月 何昭阳 Mandy C Carrie B Anderson J 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期146-148,156,共4页
通过对下载的16株小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因片段进行序列分析,合成了PPRV N基因。用NP1和NP2引物扩增。纯化的PPRV N基因在T4DNA连接酶的作用下,和PET32-a载体进行连接反应构建重组质粒pET-a-PPRV-N。经诱导表达和纯化后,得到了大量的P... 通过对下载的16株小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因片段进行序列分析,合成了PPRV N基因。用NP1和NP2引物扩增。纯化的PPRV N基因在T4DNA连接酶的作用下,和PET32-a载体进行连接反应构建重组质粒pET-a-PPRV-N。经诱导表达和纯化后,得到了大量的PPRV N蛋白。用PPRV N蛋白制备免疫血清,经国际标准血清标化后作为参考阳性血清,同时以PPRV N蛋白为抗原建立间接ELISA(I-ELISA)方法。对山东省的467份羊血清检测,使用S/P(样品值/阳性值)平均值加3倍标准差的方法,计算出其临界点为0.28。应用间接ELISA和针对H蛋白的单抗为基础的C-ELISA检测来自于疫区的69份血清,结果两者的符合率为79.7%。 展开更多
关键词 pprv N蛋白 表达 ELISA
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小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究 被引量:1
2
作者 薛忠 董淑红 王善辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第11期3327-3333,共7页
试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRVF基因克隆到已插入蜂毒信号肽(melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组... 试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRVF基因克隆到已插入蜂毒信号肽(melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA(F-Bacmid),转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(F-rBac),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 pprvF蛋白 杆状病毒 分泌表达 免疫原性 保护效果
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小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因体外转录与RT-PCR方法的研究
3
作者 张喜悦 刘春菊 +2 位作者 李林 包静月 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第9期26-28,共3页
小反刍兽疫(PPR)是由PPRV引起的主要是绵羊和山羊的一种热性病毒病。我们合成了PPRVN基因,连接到pGEM-T载体中,线性化处理后用T7转录酶启动体外转录,获取类PPRV的RNA作为阳性对照,参考国外文献设计一对合适的引物NP3和NP4,经PCR条件的优... 小反刍兽疫(PPR)是由PPRV引起的主要是绵羊和山羊的一种热性病毒病。我们合成了PPRVN基因,连接到pGEM-T载体中,线性化处理后用T7转录酶启动体外转录,获取类PPRV的RNA作为阳性对照,参考国外文献设计一对合适的引物NP3和NP4,经PCR条件的优化,获得了预期的350bp目的片断,初步建立了检测PPRVN基因的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。 展开更多
关键词 pprv 体外转录 RT-PCR
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基于N蛋白的PPRV间接ELISA检测方法的建立及应用 被引量:5
4
作者 庞文静 付明哲 +2 位作者 张琪 何亚鹏 许信刚 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2017年第11期1-8,17,共9页
【目的】原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的N蛋白,并以N蛋白为包被抗原建立血清间接ELISA检测方法。【方法】克隆PPRV N蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中进行重组N蛋白的诱导表达,对表达产物... 【目的】原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的N蛋白,并以N蛋白为包被抗原建立血清间接ELISA检测方法。【方法】克隆PPRV N蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中进行重组N蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化复性,并进行Western-blot鉴定。用复性后的N蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清中PPRV抗体水平的间接ELISA检测方法,并对其进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后用该方法对临床样品进行检测,检验其应用效果。【结果】原核表达获得大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot分析表明重组蛋白具有良好的特异性和反应原性。PPRV间接ELISA法优化反应条件为:抗原包被量每孔400ng,血清以1∶200倍稀释作用2h,酶标二抗以1∶8 000倍稀释作用1h,TMB显色时间20min,在该优化条件下,OD450≥0.309为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,该条件下对羊痘、羊口疮、羊布氏杆菌和羊魏氏梭菌血清检测结果均为阴性;对80份阳性血清进行检测,敏感性为98.7%。重复性试验表明,批内和批间OD450值的变异系数分别在2.29%~8.65%和2.13%~5.68%。用本试验建立的ELISA检测体系对临床197份血清进行检测,阳性率为85.79%,与标准试剂盒的符合率为96.4%。【结论】建立的ELISA检测方法可用于PPRV抗体水平的有效检测。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 N蛋白 原核表达 间接ELISA
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FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR检测方法的建立 被引量:4
5
作者 何亚鹏 张琪 +3 位作者 徐丽美 庞文静 付明哲 许信刚 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期1584-1589,共6页
为建立能够同时检测并鉴别口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染的多重RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应,Reverse transcriptio... 为建立能够同时检测并鉴别口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染的多重RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应,Reverse transcription-polymerase chain reaction)方法,根据3种病毒的基因组全序列和保守区序列设计3对特异性引物,优化反应体系和扩增条件,建立能够同时检测3种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法敏感性强,对FMDV、BTV和PPRV的核酸最低检测量分别为15.42、6.29、16.50ng/μL;特异性试验结果表明所建立方法的特异性良好。建立的多重RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、快速简便等特点,可以用于临床上3种病毒感染的诊断和鉴别。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 蓝舌病病毒 小反刍兽疫病毒 多重RT-PCR
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PPRV受体信号转导淋巴细胞激活分子V区功能蛋白的表达及活性分析 被引量:1
6
作者 王耀杰 吴锦艳 +4 位作者 陈妍 王光祥 尚佑军 赵兴绪 张勇 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1295-1299,共5页
信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)是小反刍兽疫病毒(PPRV)感染宿主的主要细胞受体,其N端V结构域的表达活化可以启动PPRV的入侵感染。本试验选用Slam/V结构域作为功能靶标进行表达,并分析其活性。分离山羊外周血淋巴细胞,提取其... 信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)是小反刍兽疫病毒(PPRV)感染宿主的主要细胞受体,其N端V结构域的表达活化可以启动PPRV的入侵感染。本试验选用Slam/V结构域作为功能靶标进行表达,并分析其活性。分离山羊外周血淋巴细胞,提取其基因组RNA,应用RT—PCR方法扩增山羊SLAM/V基因,构建原核表达载体pGEX-6P-1/Slam/V。将获得的重组质粒pGEX-6P-1/Slam/V转化BL21(DE3)感受态细胞,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和验证。结果显示,IPTG诱导浓度为0.1mmol/L、37℃,诱导14h时,靶标蛋白表达量最高,融合蛋白相对分子质量约为39800,且主要以包涵体形式存在。经山羊抗人SLAM蛋白多克隆抗体识别鉴定,证实其具有良好的免疫反应活性。本试验为建立稳定表达山羊SLAM/V功能区的阳性细胞克隆及PPRV侵染路径研究奠定了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 信号转导淋巴细胞激活分子 表达 活性分析
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小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立 被引量:4
7
作者 李儒曙 苏惠龙 +5 位作者 罗宝正 赵福振 薄清如 邵建宏 邓湘辉 黄铮 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期886-891,共6页
为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝... 为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒(pprv) 蓝舌病病毒(BTV) 双重荧光RT-PCR
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PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究 被引量:4
8
作者 赵文华 李富祥 杨仕标 《现代畜牧兽医》 2021年第2期5-11,共7页
为同时检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、裂谷热病毒(RVFV)及施马伦贝格病毒(SBV) 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。... 为同时检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、裂谷热病毒(RVFV)及施马伦贝格病毒(SBV) 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。结果显示:所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法可同步特异性检测PPRV、RVFV、SBV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;对临床症状相似的羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有扩增。所建立的PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法对PPRV、RVFV、SBV有特异荧光信号,检测敏感度可达10~(1.33)~10~(2.13) copies/μL DNA;而对临床症状相似羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有荧光信号。应用PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法检测925份临床样本,检出一例PPRV阳性样本,经常规RT-PCR扩增及序列测定Blast确定为PPRV谱系IV型毒株。研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法和三重实时荧光定量RT-PCR方法可同步特异性检测3种病原,并初步应用于临床样本的检测。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 裂谷热病毒 施马伦贝格病毒 三重普通RT-PCR 三重实时荧光定量RT-PCR
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病毒感染的帮凶:外泌体介导PPRV传播的新途径 被引量:1
9
作者 WAN YANG-LI CHEN YAN WANG TING 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期574-574,共1页
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起山羊、绵羊等小反刍动物的一种急性烈性高度接触性传染病,致死率高。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病,也是我国规... 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起山羊、绵羊等小反刍动物的一种急性烈性高度接触性传染病,致死率高。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病,也是我国规定的Ⅰ类动物疫病。迄今,全球超过70个国家确认境内发现PPR。2014年起,我国先后有25个省市自治区先后发生PPR疫情。PPRV感染宿主后传播迅速是其致病的主要特征,探寻该病毒感染宿主后的传播途径及其机制是该领域亟待解决的突出问题。外泌体(Exosomes)是一类介导细胞间通讯的纳米级囊泡. 展开更多
关键词 小反刍兽疫 世界动物卫生组织 接触性传染病 动物疫病 病毒感染 pprv OIE 细胞间通讯
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一例PPRV阳性羊鼻拭子样本N、P、M、F、H基因的序列测定和遗传进化分析
10
作者 赵文华 李富祥 +1 位作者 尹伟 杨仕标 《现代畜牧兽医》 2020年第12期8-13,共6页
为对采集自昆明某大型牲畜交易市场的一例PPRV阳性鼻拭子样本进行追根溯源,设计引物采用RT-PCR方法进行PPRV病毒基因组关键基因N、P、M、F、H核苷酸序列扩增,并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示:N、P、M、F、H基因均有预期片段扩增... 为对采集自昆明某大型牲畜交易市场的一例PPRV阳性鼻拭子样本进行追根溯源,设计引物采用RT-PCR方法进行PPRV病毒基因组关键基因N、P、M、F、H核苷酸序列扩增,并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示:N、P、M、F、H基因均有预期片段扩增,其读码框(ORF)长度分别为1 578、1 531、1 008、1 641及1 830 nt;N、P、M、F及H构建的遗传进化树均显示所测毒株为基因Ⅳ型,同2013年在新疆伊犁山羊中检测到的毒株(KM091959)同源性最高,N、P、M、F、H核苷酸同源性分别为99.2%、99.0%、99.4%、99.6%和99.3%,推断氨基酸同源性分别为98.7%、98.4%、100.0%、99.8%和99.3%。研究表明,检测到的毒株仍为2013~2014年我国PPRV流行期的基因Ⅳ型毒株,变异较小;所测毒株的N、P、M、F、H 5个关键基因中,M基因最保守、其次是F/H基因,而N、P基因略有变异。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 普通RT-PCR N、P、M、F、H基因 序列测定 遗传进化分析 基因Ⅳ型
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An evaluation of a perfluoromethylcyclohexane(PMCH) permeation plug release vessel(PPRV) in a controlled turbulent environment
11
作者 Jong Edmund C. Luxbacher Kray D. 《International Journal of Mining Science and Technology》 SCIE EI CSCD 2015年第2期243-251,共9页
The use of sulfur hexafiuoride (SF6) as a tracer gas for analyzing underground mine ventilation systems has been practiced for over 30 years. As a result, the methods used to release, sample, and analyze SF6 are wel... The use of sulfur hexafiuoride (SF6) as a tracer gas for analyzing underground mine ventilation systems has been practiced for over 30 years. As a result, the methods used to release, sample, and analyze SF6 are well accepted. As the complexity and size of underground mine ventilation networks increase, the ability of a SF6 to function as a convenient and rapid means of analysis diminishes. The utilization of multiple tracer gases can mitigate this by removing the need to purge the background presence of a tracer before conducting another release and allowing for a more comprehensive evaluation using multi-zone tech- niques. Recent studies have identified perfluoromethylcyclohexane (PMCH) as a possible supplement for SF6 in underground mine ventilation tracer studies. However, the deployment of PMCH remains a challenge because of this compounds physical properties. This paper evaluates a PMCH permeation plug release vessel (PPRV) under controlled turbulent conditions. The details of the experimental parameters used in the evaluation as well as a discussion regarding the performance of the PPRV are included. 展开更多
关键词 Tracer gas Underground mines Mine ventilation Perfluoromethylcyclohexane
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宁夏野生岩羊PPRV全基因组测定与系统进化分析
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作者 阚龙飞 孟宪踊 +10 位作者 闫飞虎 李元果 王铁成 徐钰 初冬 王卫东 李岳城 赵永坤 高玉伟 冯娜 夏咸柱 《野生动物学报》 北大核心 2023年第3期556-564,共9页
为探究宁夏野生岩羊(Pseudois nayaur)小反刍兽疫病毒(Peste des petits rumi-nants virus,PPRV)的分子遗传特征,根据Gen Bank公布的PPRV基因组序列设计并合成13对全基因组扩增引物,通过RT-PCR和DNA测序及拼接获取毒株(wild-bharal/Chin... 为探究宁夏野生岩羊(Pseudois nayaur)小反刍兽疫病毒(Peste des petits rumi-nants virus,PPRV)的分子遗传特征,根据Gen Bank公布的PPRV基因组序列设计并合成13对全基因组扩增引物,通过RT-PCR和DNA测序及拼接获取毒株(wild-bharal/China-NXYH/2021株)全基因组序列,借助DNASTAR和MEGA 7.0软件进行序列分析。结果显示:该毒株属于基因Ⅳ系,基因组全长为15954 nt;在系统进化上,与2013年以来中国流行株和2016—2017年蒙古流行株亲缘关系较近,共同组成一个小的进化分支;在全基因组一致性分析中,与国内新疆流行株goat/China-XJYL/2013一致性最高(99.4%),与国内其他野生动物PPRV株wild-bharal/China-Tibet/2008、Ibex/China-XJBZ/2015和Procapra-przewalskii/China-GS/2018的一致性分别为96.8%、98.8%和99.0%。在H和F蛋白氨基酸多态性分析中,发现该毒株H和F蛋白中均出现了独特的氨基酸突变,分别为H蛋白的R285Q、S421R和F蛋白的R/K/T3W、Q305R。结果表明,小反刍兽疫病毒已传入宁夏野生动物种群,为我国小反刍兽疫根除工作带来新的困难和挑战,需加强对宁夏野生动物PPRV感染情况的追踪和监测,以便及时从传染源和传播途径方面阻断PPRV的传播。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 野生岩羊 宁夏 全基因组测定 系统进化分析
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铁代谢:宿主细胞与病毒“殊死搏斗”争夺的关键阵地
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作者 《中国兽医科学》编辑部 王晶钰(审核) 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第7期994-994,共1页
病毒作为严格的细胞内寄生生物,能够劫持宿主铁代谢过程促进自身完成生命周期。2025年3月24日,西北农林科技大学王晶钰教授带领的研究团队在m Bio上发表了题为“The long noncoding RNA APR attenuates PPRV infection-induced accumula... 病毒作为严格的细胞内寄生生物,能够劫持宿主铁代谢过程促进自身完成生命周期。2025年3月24日,西北农林科技大学王晶钰教授带领的研究团队在m Bio上发表了题为“The long noncoding RNA APR attenuates PPRV infection-induced accumulation of intracellular iron to inhibit membrane lipid peroxidation and viral replication”的研究论文,从铁代谢的角度揭示了小反刍兽疫病毒(PPRV)与宿主细胞相互作用的机制,展现出PPRV在感染过程中与宿主细胞围绕铁代谢这一重要“阵地”彼此斗争的复杂过程。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒(pprv) 铁过载 脂质过氧化 铁死亡 lncRNA调控
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山羊肾细胞氧化还原状态对小反刍兽疫病毒体外复制的影响
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作者 杨紫倩 郭薇 +1 位作者 陈绍红 刘铀 《中国草食动物科学》 北大核心 2025年第5期16-26,共11页
为研究山羊肾细胞(LDG-2)氧化还原状态对小反刍兽疫病毒(PPRV)体外复制的影响,采用MTT法分别测定N-乙酰半胱氨酸(NAC)、维生素C(VC)、还原型谷胱甘肽(GSH)和叔丁基过氧化氢(TBHP)的安全浓度及PPRV感染细胞活力;分别用DCFH-DA荧光探针和E... 为研究山羊肾细胞(LDG-2)氧化还原状态对小反刍兽疫病毒(PPRV)体外复制的影响,采用MTT法分别测定N-乙酰半胱氨酸(NAC)、维生素C(VC)、还原型谷胱甘肽(GSH)和叔丁基过氧化氢(TBHP)的安全浓度及PPRV感染细胞活力;分别用DCFH-DA荧光探针和ELISA检测了与细胞氧化应激和氧化还原状态有关的活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶(NOX)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;用IFA和Western-blot观察PPRV在LDG-2细胞中的复制与增殖。结果表明,PPRV感染的LDG-2细胞中的ROS水平、MDA含量,以及NOX和XOD活性极显著增加(P<0.001),GSH-Px活性显著降低(P<0.05),PPRV-N蛋白表达水平显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01)。NAC和GSH处理能极显著降低PPRV感染细胞的ROS水平、MDA含量,以及NOX和XOD活性(P<0.001),PPRV-N蛋白表达水平显著下调(P<0.05或P<0.01)。经VC和TBHP处理的PPRV感染细胞中ROS水平、MDA含量,以及NOX和XOD活性极显著升高(P<0.01或P<0.001),PPRV-N蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。上述结果表明,PPRV感染可诱导LDG-2细胞的氧化应激,NAC和GSH可缓解PPRV感染细胞的氧化应激,进而抑制病毒的复制,TBHP和VC则可通过增强PPRV诱导的氧化应激促进病毒复制。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 山羊肾细胞 氧化应激 病毒复制
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异绿原酸A通过PERK信号通路缓解小反刍兽疫病毒诱导的内质网应激
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作者 穆芸 孙甜甜 +5 位作者 邝永胜 袁书艺 刘艳芬 陈绍红 刘铀 郭富城 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1408-1417,共10页
病毒感染可诱导宿主细胞产生内质网应激(ERS)与未折叠蛋白反应(UPR),导致内质网稳态失衡。为了探讨异绿原酸A(IAA)在调节小反刍兽疫病毒(PPRV)诱导的ERS和UPR中的作用机制,采用MTT试验、间接免疫荧光试验和Western blot评估IAA的抗PPRV... 病毒感染可诱导宿主细胞产生内质网应激(ERS)与未折叠蛋白反应(UPR),导致内质网稳态失衡。为了探讨异绿原酸A(IAA)在调节小反刍兽疫病毒(PPRV)诱导的ERS和UPR中的作用机制,采用MTT试验、间接免疫荧光试验和Western blot评估IAA的抗PPRV活性;采用Western blot和实时荧光定量PCR观察IAA对PPRV诱导的ERS及PERK信号通路的影响。结果表明,IAA能显著抑制PPRV在LDG-2细胞中的复制及病毒诱导的细胞病变,显著提高病毒感染细胞的存活率;与病毒对照组相比,IAA处理的PPRV感染细胞中GRP78和PPRV表达水平、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值均显著降低;GADD153表达水平则在病毒感染24、36h显著降低,在48、60h显著升高。用4-PBA阻断PPRV诱导的ERS,IAA和4-PBA+IAA处理PPRV感染细胞中GRP78、PPRV-N蛋白、GADD153的表达水平及p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK比值均显著降低。由此可见,IAA可通过抑制PERKeIF2α-GADD153信号通路的激活缓解PPRV感染诱导的ERS,从而抑制病毒在宿主细胞的复制。 展开更多
关键词 异绿原酸A 小反刍兽疫病毒(pprv) 内质网应激(ERS) PERK信号通路
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C基因沉默的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株反向遗传学系统的建立
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作者 李菊 石晓玲 +6 位作者 杨晓莉 杨东亮 毕冬琳 刘方程 张潇文 李琼毅 柏家林 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期563-573,共11页
为建立小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)反向遗传学体系,本研究以PPRV Nigeria75/1疫苗株基因组序列为基础,PCR分7个片段扩增病毒基因组,运用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)在3’... 为建立小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)反向遗传学体系,本研究以PPRV Nigeria75/1疫苗株基因组序列为基础,PCR分7个片段扩增病毒基因组,运用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)在3’端引入锤头状核酶(Hammerhead ribozyme,HamRz)、5’端引入丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis D virus ribozyme,HdvRz)和T7终止子,构建PPRV全长cDNA感染性克隆质粒pBluescript SK-PPRV,进一步构建C基因沉默的病毒全长cDNA感染性克隆染质粒pBluescript SK-PPRVΔC。pBluescript SK-PPRVΔC、pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L共转染BSR T7/5细胞,48 hpt后收集细胞反复冻融上清液感染山羊子宫内膜上皮细胞(GEECs),盲传3代,拯救重组病毒命名为rPPRVΔC。重组病毒感染GEECs细胞中RT-PCR扩增出病毒N、P和部分L基因(L2)片段,Western blot检测到N蛋白表达、C蛋白未表达,IFA也检测到N蛋白表达,成功建立了PPRV Nigeria75/1株反向遗传学体系。研究结果为PPRV新型标记疫苗的研制及C蛋白致病机理研究奠定了基础。 展开更多
关键词 pprv Nigeria 75/1疫苗株 C基因 SOE-PCR 病毒拯救 反向遗传学
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小反刍兽疫病毒诱导的内质网应激对山羊肾细胞PERK信号通路和细胞凋亡的影响 被引量:1
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作者 邝永胜 穆芸 +5 位作者 孙甜甜 袁书艺 刘艳芬 陈绍红 郭富城 刘铀 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1882-1891,共10页
病毒感染可引起宿主细胞产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),导致内质网稳态失衡。为了深入探讨小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染诱导的ERS... 病毒感染可引起宿主细胞产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),导致内质网稳态失衡。为了深入探讨小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染诱导的ERS对宿主细胞UPR信号通路、病毒复制和细胞凋亡的影响,采用MTT试验测定、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot观察PPRV在山羊肾细胞(LDG-2)的增殖,采用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)观察PPRV感染对GRP78、PERK及其下游信号分子、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平的影响。结果显示,PPRV感染36 h后,细胞存活率显著降低并产生明显细胞病变,PPRV-N蛋白表达水平呈上升趋势,且在病毒感染30 h后显著高于细胞对照;与此同时,GRP78、p-eIF2α和GADD153表达水平、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值均显著升高。用4-PBA阻断PPRV诱导的ERS,PPRV感染细胞中PPRV-N蛋白、GRP78、p-eIF2α和GADD153表达水平及p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK比值均显著降低。在PPRV感染30和36 h,与细胞凋亡相关的Bcl-2表达下调,Bax表达上调,Bcl-2/Bax比值则显著降低。由此可见,PPRV感染可激活PERK/eIF2α/GADD153信号通路,缓解病毒诱导的ERS,促进病毒复制;阻断PPRV诱导的ERS,可抑制PERK信号通路和病毒复制;PPRV感染和持续的ERS可诱导宿主细胞凋亡。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 内质网应激 信号通路 细胞凋亡
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羊口疮、小反刍兽疫、羊痘病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及应用
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作者 朱成 田芯源 +4 位作者 陈易 余燕岐 王宪军 朱江江 向华 《四川畜牧兽医》 2024年第10期33-37,40,共6页
为建立一种羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)三种病原的联合共检方法,以ORFV、GTPV和PPRV基因序列为模板,克隆得ORFV-B2L、GTPV-p32、PPRV-N基因序列,并构建三种病原核酸标准品,设计三对探针,建立ORFV、GTPV和... 为建立一种羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)三种病原的联合共检方法,以ORFV、GTPV和PPRV基因序列为模板,克隆得ORFV-B2L、GTPV-p32、PPRV-N基因序列,并构建三种病原核酸标准品,设计三对探针,建立ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法,然后对方法的检测条件进行优化及质量评价,并作临床初步验证。结果显示:所建立的ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法的特异性好,ORFV、PPRV和GTPV最低检测限值分别为2.98×101、3.81×101、6.68×10^(1)copies/μL;稳定性好,与商品化检测试剂盒和OIE标准相比具有较高的检测符合率;对279份临床样本作检测,ORFV、PPRV和GTPV的阳性检出率分别为34%、4.3%、2.5%,ORFV和GTPV的混合感染率为2.5%。 展开更多
关键词 羊口疮病毒(ORFV) 小反刍兽疫病毒(pprv) 羊痘病毒(GTPV) 多重TaqMan荧光定量PCR
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小反刍兽疫病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立 被引量:1
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作者 许芳 蔡杰 +3 位作者 薛华平 罗均 蒋永青 郭霄峰 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期1-7,共7页
为建立一种能准确、灵敏地检测小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的ELISA方法,通过诱导BL21(DE3)-pET-30a-PPRV N表达菌种获得PPRV N蛋白,将纯化的PPRV N蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得1株能够高效表... 为建立一种能准确、灵敏地检测小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的ELISA方法,通过诱导BL21(DE3)-pET-30a-PPRV N表达菌种获得PPRV N蛋白,将纯化的PPRV N蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得1株能够高效表达、稳定分泌和具有较好竞争效果的抗PPRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1G2)。以纯化的PPRV N蛋白为包被抗原,HRP标记的1G2单克隆抗体(1G2-HRP)作为竞争抗体,建立了小反刍兽疫病毒竞争ELISA(competitive ELISA,cELISA)抗体检测方法。经优化反应条件确定最佳抗原包被浓度为1.0μg/mL,待检血清最佳稀释条件为4倍稀释,1G2-HRP酶标抗体最佳工作浓度为250 ng/mL;当阻断率(PI值)小于42%,判定为抗体阴性;阻断率大于或等于42%,判定为抗体阳性。该方法最低可检测128倍稀释的PPRV抗体阳性血清,具有较高的敏感性;仅能检测PPRV抗体,与羊源常见病原和pET-30a-BL21(DE3)的抗体阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间变异系数均小于15%,具有良好的重复性。该方法与血清中和试验的阳性符合率为87.80%(95%CI:73.80,95.92),阴性符合率为94.95%(95%CI:88.61,98.34),总符合率为92.86%(95%CI:84.11,97.64),Kappa值为0.83(95%CI:53.10,112.50),具有较高的符合率。表明建立的ELISA方法在我国PPRV的流行病学调查、疫苗免疫效果评估方面具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 小反刍兽疫病毒N蛋白 竞争酶联免疫吸附试验
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小反刍兽疫病毒诱导巨噬细胞产生炎症反应
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作者 李玲霞 韩生义 +2 位作者 李淑萍 尚佑军 李生庆 《生物技术》 CAS 2024年第1期76-84,119,共10页
[目的]探究小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染引起的炎症反应并解析其致病机制。[方法]分离山羊肺泡巨噬细胞(PAM),利用qRT-PCR、ELISA及组织病理切片HE染色等方法分别检测PPRV感染后引起的炎性细胞因子表达... [目的]探究小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染引起的炎症反应并解析其致病机制。[方法]分离山羊肺泡巨噬细胞(PAM),利用qRT-PCR、ELISA及组织病理切片HE染色等方法分别检测PPRV感染后引起的炎性细胞因子表达、一氧化氮(NO)含量和炎性细胞侵润等现象。进一步利用转录组学测序分析PPRV感染PAM引起的差异基因、信号通路以及差异基因的表达情况。[结果]与正常山羊相比,感染PPRV的山羊其肝脏、肾脏及肺脏的部分细胞坏死并且呈现炎性细胞侵润的现象;与对照组相比,感染后的PAM细胞显著增加了NO含量(P<0.001);与未感染组相比,PPRV感染的PAM其炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10等mRNA表达水平显著升高(P<0.05);此外,PPRV感染诱导的差异基因主要集中在炎症通路及NF-κB信号通路等。[结论]PPRV通过诱导大量炎性细胞侵润、增加炎性细胞因子表达,激活炎症信号通路从而产生炎症反应。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 感染 巨噬细胞 炎症反应 信号通路 天然免疫 发病机制
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