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结核分枝杆菌PPE61蛋白的表达与纯化及其对BEAS-2B细胞增殖和TGF-β表达的影响
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作者 黄俊程 薄新文 +9 位作者 冯昕炜 李静 陈旭珂 赵家欣 赵佳楠 魏琳颖 张艳艳 孙艳 王正荣 齐萌 《中国动物检疫》 2026年第2期50-61,共12页
PPE61是结核分枝杆菌特有的PPE蛋白家族成员,它的可变C端与分泌特性暗示其在免疫逃逸和宿主互作中起关键作用。然而,该蛋白对呼吸道屏障上皮细胞的具体功能未知。本研究通过体外试验,旨在阐明PPE61对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)增殖的调... PPE61是结核分枝杆菌特有的PPE蛋白家族成员,它的可变C端与分泌特性暗示其在免疫逃逸和宿主互作中起关键作用。然而,该蛋白对呼吸道屏障上皮细胞的具体功能未知。本研究通过体外试验,旨在阐明PPE61对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)增殖的调控作用及其在感染早期的分子机制,为结核病诊断与疫苗研发提供理论依据。采用生物信息学软件预测PPE61蛋白的基本生物学性质,基于NCBI数据库获取结核分枝杆菌PPE61基因及其编码蛋白序列信息。通过PCR从卡介苗(BCG)基因组中扩增出PPE61基因,并构建了重组表达质粒pET22b(+)-PPE61,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主中进行蛋白表达。通过SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达及抗原性;采用CCK-8法检测不同质量浓度(2.5~20μg/mL)PPE61处理BEAS-2B细胞24 h的增殖活性,应用qPCR分析TGF-β基因表达水平。结果显示:PPE61基因扩增后全长1287 bp,编码406个氨基酸,该蛋白无信号肽和跨膜区,预测含37个磷酸化位点,41个B细胞抗原表位和35个T细胞抗原表位,二级结构以α-螺旋(49.26%)为主;经SDS-PAGE分析发现该蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为105.65218×10~5,与预期大小相符合,说明重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,能诱导表达目标蛋白。Western blot证实PPE61抗原具有特异性;其浓度依赖性抑制细胞增殖(P≤0.0001),可显著上调TGF-β表达(P<0.05)。结果表明:PPE61蛋白具备丰富的抗原表位和高可溶性表达特性,预示其拥有良好的免疫原性与开发潜力,为筛选结核病诊断标志物和研发新型亚单位疫苗提供了新靶点,奠定了重要的试验基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ppe61蛋白 生物信息学 原核表达 BEAS-2B细胞
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PPE61重组耻垢分枝杆菌对胁迫压力的响应及MAPK/NF-κB信号的调节
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作者 宋丽 梁志航 +2 位作者 毕静 郭庆龙 张国良 《微生物学报》 北大核心 2025年第12期5380-5391,共12页
【目的】比较重组耻垢分枝杆菌Ms-PPE61与Ms-Vec在不同体外应激条件下的抗压能力,研究二者感染巨噬细胞后MAPK/NF-κB信号通路的激活/抑制水平,并探究感染RAW264.7细胞后炎症细胞因子表达差异。【方法】构建Ms-Vec和Ms-PPE61菌株,培养... 【目的】比较重组耻垢分枝杆菌Ms-PPE61与Ms-Vec在不同体外应激条件下的抗压能力,研究二者感染巨噬细胞后MAPK/NF-κB信号通路的激活/抑制水平,并探究感染RAW264.7细胞后炎症细胞因子表达差异。【方法】构建Ms-Vec和Ms-PPE61菌株,培养至对数生长期后分别置于酸性、SDS、H2O2条件下处理,检测不同时间点的菌落形成单位(colony-forming unit,CFU);收集感染后1-48 h的细胞,提取蛋白,用Western blotting检测信号通路标志分子表达水平;用Ms-Vec和Ms-PPE61菌株分别感染RAW264.7细胞24 h和48 h,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测上清中IL-6、 TNF-α及IL-1β的浓度;数据用GraphPad Prism 7.0分析,进行ANOVA方差分析,P<0.05为显著。【结果】PCR结果显示,Ms-PPE61有目的条带,Ms-Vec无目的条带;考马斯亮蓝染色显示蛋白上样水平一致,Western blotting显示Ms-PPE61表达约42 kDa的Flag融合蛋白,Ms-Vec无融合蛋白。采用超高速离心分离耻垢分枝杆菌组分,Western blotting结果显示细胞质标记蛋白GroES在Ms-Vec和Ms-PPE61细胞质中均有表达,含Flag标签的目的蛋白仅存在于Ms-PPE61细胞壁。在酸性条件(pH 3.0)下处理3 h时Ms-PPE61的存活率显著高于Ms-Vec(P<0.000 1),6 h和9 h时无显著差异(P>0.05);在0.2%SDS条件下处理3、6和9 h时Ms-PPE61的存活率均显著高于Ms-Vec(P<0.000 1);H2O2处理后3 h和6 h,Ms-PPE61的存活率也显著高于Ms-Vec(P<0.000 1)。Western blotting检测显示,Ms-PPE61组p-p38和p-ERK在感染48 h时显著降低,IκB-α在各时间点均高于Ms-Vec组。ELISA检测显示,Ms-PPE61组TNF-α的分泌水平在24 h和48 h时无显著差异(P>0.05),IL-6在24 h和48 h时显著低于Ms-Vec组(P<0.000 1),IL-1β在48 h时显著低于Ms-Vec组(P<0.01)。【结论】PPE61可增强重组耻垢分枝杆菌对酸性、SDS及H2O2胁迫的耐受能力,能通过下调p-p38和p-ERK的表达、上调IκB-α的表达来抑制MAPK和NF-κB信号通路,还可减少巨噬细胞中IL-6的分泌(24 h和48 h均显著)及IL-1β的分泌(48 h显著),但对TNF-α的分泌无显著影响。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ppe61 胁迫压力 MAPK信号通路 NF-ΚB信号通路
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