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稳定表达牛分枝杆菌PPE13的THP-1细胞株的建立
1
作者 刘卓彤 毕斯琪 +3 位作者 孟祥苗 胡燕萍 宋厚辉 杨杨 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期179-184,共6页
为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制,本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先,采用分子克隆技术,以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段,构建含有ppe13片段的重组慢病毒... 为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制,本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先,采用分子克隆技术,以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段,构建含有ppe13片段的重组慢病毒表达质粒,将该质粒和慢病毒包装质粒转染至239T细胞中,72 h后收集病毒。然后,将获得的病毒感染THP-1细胞中,经1μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达PPE13的细胞株THP-1/PPE13。最后,使用ELISA方法检测稳定表达细胞系中TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的情况,以验证细胞系中PPE13的生物学活性。结果显示,相较于对照细胞THP-1/Con,THP-1/PPE13中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平均显著升高。该细胞系的建立为深入研究PPE13调控细胞信号通路的功能提供了实验基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 ppe13 慢病毒包装 稳定表达
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牛分枝杆菌PPE13蛋白基因的表达及其表达产物的功能分析 被引量：2
2
作者 何萍 徐翩翩 +1 位作者 杨杨 宋厚辉 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1548-1553,共6页
为了探索PPE13蛋白在牛分枝杆菌感染宿主细胞中所发挥的具体调控作用,本研究利用分子克隆技术构建了表达PPE13蛋白的耻垢分枝杆菌重组菌株Ms_PPE13。首先采用PCR技术扩增mb0902c（PPE13）基因片段,将其克隆于载体pMN437中。挑取阳性克... 为了探索PPE13蛋白在牛分枝杆菌感染宿主细胞中所发挥的具体调控作用,本研究利用分子克隆技术构建了表达PPE13蛋白的耻垢分枝杆菌重组菌株Ms_PPE13。首先采用PCR技术扩增mb0902c（PPE13）基因片段,将其克隆于载体pMN437中。挑取阳性克隆测序后,将重组质粒电转至耻垢分枝杆菌中,通过Western-blot方法检测PPE13蛋白是否在耻垢分枝杆菌中表达。然后测定重组菌株Ms_PPE13的体外生长曲线、感染该菌的巨噬细胞的死亡情况以及使用荧光定量PCR方法检测巨噬细胞内炎症相关因子IL-6、TNF-α和i NOS的表达情况,以初步探索PPE13的功能。结果显示,PPE13蛋白可在耻垢分枝杆菌中表达,并且PPE13的表达不影响耻垢分枝杆菌在体外的生长。另外,使用耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞后,发现PPE13可促进巨噬细胞的死亡,并且促进IL-6的表达。上述研究结果为进一步探索PPE13蛋白调控牛分枝杆菌感染的具体机制提供了新的线索。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 ppe13 耻垢分枝杆菌 巨噬细胞 细胞死亡 IL-6
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利用CRISPRi技术敲低海分枝杆菌PPE13基因
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作者 王垚垚 毕斯琪 +2 位作者 陈标 宋厚辉 杨杨 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1670-1676,共7页
为研究分枝杆菌PPE13基因在宿主细胞的生物功能,本试验利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference,CRISPRi)构建海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株。CRISPRi主要包... 为研究分枝杆菌PPE13基因在宿主细胞的生物功能,本试验利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference,CRISPRi)构建海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株。CRISPRi主要包括表达失活的Cas9蛋白(dead cas9,dCas9)和特异性单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),通过形成复合体特异性识别相应DNA序列并抑制目的基因的转录。用无水四环素(anhydrotetracycline,ATC)诱导海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株,提取细菌RNA,利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)技术检测dCas9、PPE13基因的表达情况,观察细菌在不同时间D600 nm的变化,分析诱导剂质量浓度和目的基因转录水平之间的关系。使用PPE13敲低菌株感染巨噬细胞并检测胞内菌的存活情况。结果表明,在ATC诱导后,dCas9表达水平显著增高。针对PPE13基因设计的4个sgRNA中,sgRNA1对PPE13基因转录的抑制作用最为明显,为70%~90%。生长曲线结果显示,敲低PPE13菌株在48 h内D600 nm无明显变化。诱导剂的质量浓度越高,对PPE13基因的转录水平的抑制作用越强。敲低PPE13可降低细菌在细胞内的增殖能力。本研究构建了海分枝杆菌PPE13敲低菌株,为深入研究分枝杆菌PPE13感染宿主细胞的致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPRi 海分枝杆菌 ppe13 敲低
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