复合益生菌产品中副干酪乳酪杆菌活菌定量的PMA-qPCR方法研究

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作者 焦颖欣 郭立峥 +5 位作者 宋程羽 宋智泉 冯会粉 迮晓雷 葛媛媛 姚粟 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第22期360-367,共8页

复合益生菌产品的活菌数是评估其质量和功效的关键参数。然而,如何在复合益生菌产品中实现特定菌种活菌数的精准检测是目前行业内面临的技术难题。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术,... 复合益生菌产品的活菌数是评估其质量和功效的关键参数。然而,如何在复合益生菌产品中实现特定菌种活菌数的精准检测是目前行业内面临的技术难题。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术,可有效区分死活菌,精确检测多菌种体系中目标菌种的活菌数。该研究以副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)为研究对象,通过比较7种常用DNA提取方法的效率并优化PMA前处理条件,建立了基于PMA-qPCR的活菌定量检测方法,并对其特异性和适用性进行了验证。结果表明,采用珠式研磨仪破碎法一步式提取DNA时,其提取效率优于其他方法。当PMA浓度为50μmol/L,暗孵育5 min并曝光15 min时,此条件能够有效区分死活菌。该方法的定量限为8.07×10^(3)CFU/mL。特异性和适用性验证结果表明,所建立的PMA-qPCR方法特异性较好,能够在复合益生菌产品中精确测定L.paracasei的活菌数,并能有效识别未标示添加量的样品中是否存在活性L.paracasei。该方法为复合益生菌产品的质量控制和行业标准化提供了可靠的技术支持,为益生菌产品的质量监管提供了新的技术选择。 展开更多

关键词 副干酪乳酪杆菌 活菌定量 pma-qpcr技术 复合益生菌产品 质量控制

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基于PMA-qPCR分析的电子束辐照杀灭微生物机制研究

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作者 冯雨宸 冼嘉恒 +5 位作者 刘宵宵 高瑞芳 王一淳 肖萌 刘坤 余道坚 《植物检疫》 2024年第5期14-20,共7页

本研究通过优化PMA实时荧光定量PCR条件获得大肠杆菌等3种指示微生物分析的最佳PMA条件,并设置1~5 kGy梯度剂量进行电子束辐照后,应用PMA-qPCR测试并使用SPSS软件对RQ值进行方差分析,推断辐照破坏细胞膜渗透性的作用机制。试验结果表明... 本研究通过优化PMA实时荧光定量PCR条件获得大肠杆菌等3种指示微生物分析的最佳PMA条件,并设置1~5 kGy梯度剂量进行电子束辐照后,应用PMA-qPCR测试并使用SPSS软件对RQ值进行方差分析,推断辐照破坏细胞膜渗透性的作用机制。试验结果表明,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌黑色变种的最佳PMA浓度均为50μmol/L,最适光解时间分别为30 min、15 min和60 min。辐照剂量、PMA处理以及两者的交互作用均显著(P≤0.001)。3种微生物PMA处理组的RQ值均低于未经PMA处理组的RQ值(除去枯草芽孢杆菌的3~5 kGy处理),并且随着辐照剂量的增加,经PMA处理后的RQ值在3种微生物中总体呈现下降趋势,据此推测电子束辐照可能破坏了3种微生物的细胞膜。推荐以上3种微生物的电子束辐照灭活剂量为5 kGy。 展开更多

关键词 电子束 辐照 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 pma-qpcr 消毒

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PMA-qPCR方法用于监测超声波灭菌效率的适用性及其应用 被引量：10

3

作者 李聪聪 余以刚 +2 位作者 邱杨 肖性龙 郭毅岱 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2012年第4期409-411,423,共4页

为研究PMA-qPCR方法的适用性问题,本文以超声波制备膜损伤细菌,用PMA-qPCR方法进行检测,并与平板计数的结果进行比较,证明该方法适用于监测超声波法灭菌率的监测。将该方法用于检测不同因素对超声波灭菌效率的影响,表明在温度和超声频... 为研究PMA-qPCR方法的适用性问题,本文以超声波制备膜损伤细菌,用PMA-qPCR方法进行检测,并与平板计数的结果进行比较,证明该方法适用于监测超声波法灭菌率的监测。将该方法用于检测不同因素对超声波灭菌效率的影响,表明在温度和超声频率一定的条件下,处理时间和功率对灭菌效率的影响比较明显,而占空比对其影响较小。 展开更多

关键词 pma-qpcr 超声波 灭菌率

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黄瓜细菌性角斑病PMA-qPCR检测方法的建立和应用 被引量：8

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作者 孔维文 李云龙 +4 位作者 王敬琦 刘婷婷 陈南 金一 何晓青 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期70-75,共6页

黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同... 黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同株的gap1基因序列,找出gap1基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物Dxf1和Dxr1,以其他5种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量PCR扩增,只有丁香假单胞菌有扩增曲线,证明引物非常特异。(2)以gap1基因为目的基因构建其克隆载体,将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养,使其大量复制。再将质粒提取,以提取的质粒作为标准品,根据其浓度将其稀释为5×101-5×107 7个梯度绘制标准曲线,获得的扩增效率为96.6%,并做组内重复和组间重复,变异系数均在2%内,证明标准曲线重复性良好。(3)将构建好的方法用于实际样品的检测,得到的Ct值为27.99,根据标准曲线所得的起始模板与Ct值之间的线性关系公式,检测到100 mg患病叶片中含有的菌体为7.69×102拷贝。研究表明,该方法可以快速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量,为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持。 展开更多

关键词 黄瓜细菌性角斑病 pma-qpcr 丁香假单胞菌 检测 有活力菌体

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PMA-qPCR法检测冷冻基质中非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌 被引量：6

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作者 黄新新 杨娟 +2 位作者 郑江 何宇平 蔡强 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期934-940,共7页

【背景】副溶血性弧菌为冰鲜产品及肉制品中常见的污染微生物,致病性强,危害严重,出入境运输及加工的肉食品常采取冷冻冷藏的处理手段来防止微生物污染及生长,以保持食物新鲜。而残留的部分副溶血性弧菌会进入活的非可培养状态(Viable b... 【背景】副溶血性弧菌为冰鲜产品及肉制品中常见的污染微生物,致病性强,危害严重,出入境运输及加工的肉食品常采取冷冻冷藏的处理手段来防止微生物污染及生长,以保持食物新鲜。而残留的部分副溶血性弧菌会进入活的非可培养状态(Viable but non-culturable state,VBNC),从而构成潜在的风险隐患。【目的】建立可用于冷冻食品中VBNC副溶血性弧菌的快速检测方法,并探讨其适用性。【方法】将大西洋鲑鱼1:10匀浆,加入终浓度为6.6×10~5 CFU/mL的副溶血性弧菌,-20°C分别诱导10、20、30和50 d。建立实时荧光PCR技术(qPCR)方法,测定其特异性、灵敏度及稳定性。利用PMA-qPCR法对不同冷冻时期样品中的副溶血性弧菌进行检测,同时与qPCR、平板培养法进行比较。【结果】建立的qPCR方法特异性好,与其他阴性参考株无交叉反应;灵敏度高,检测限为19.8 CFU/mL;重复性好,C_q值的变异系数(CV)均在1.5%以下;标准曲线为y=-3.272x+45.310,线性回归系数R^2为0.996,定量范围为1×10~2–1×10~9 CFU/mL。在低温诱导10-50 d后,qPCR法的C_q值在26.32-27.34之间,与诱导前相比几乎没有变化;叠氮溴化丙锭(PMA)-qPCR法的C_q值则从诱导前的26.43逐步上升到38.84,呈现明显的上升趋势,表明死菌的数量在显著上升。经过比较及统计,PMA-qPCR检测的活菌数均高于平板培养法测出的数量,差异显著(P<0.05)。【结论】PMA-qPCR特异性及灵敏度高,能有效抑制对死菌的扩增,同时能克服传统平板培养法对VBNC的漏检缺陷,可方便、快捷地用于冷冻食品中受损致病微生物,尤其是进入VBNC状态的细菌检测。 展开更多

关键词 副溶血性弧菌 冷冻食品 非可培养状态(VBNC) 叠氮溴化丙锭-实时荧光PCR技术(pma-qpcr)

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不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析 被引量：3

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作者 刘羽霏 方祥 +2 位作者 廖振林 王丽 钟青萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第20期215-221,共7页

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative po... 定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。 展开更多

关键词 副溶血弧菌 活的非可培养(VBNC)状态 pma-qpcr 流式细胞仪 激光扫描共聚焦显微镜

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解淀粉芽孢杆菌TF28活菌定量PMA-qPCR技术

7

作者 张淑梅 姜威 +3 位作者 胡基华 孟利强 李晶 夏海华 《生物技术》 CAS 2020年第4期346-351,共6页

[目的]建立解淀粉芽孢杆菌TF28特异性活菌分子定量技术。[方法]基于TF28特有基因设计qPCR引物,建立菌株特异性qPCR技术;优化PMA处理条件,建立PMA-qPCR定量TF28活菌技术,对其特异性、灵敏性与可靠性进行检测。[结果]建立的qPCR技术对菌株... [目的]建立解淀粉芽孢杆菌TF28特异性活菌分子定量技术。[方法]基于TF28特有基因设计qPCR引物,建立菌株特异性qPCR技术;优化PMA处理条件,建立PMA-qPCR定量TF28活菌技术,对其特异性、灵敏性与可靠性进行检测。[结果]建立的qPCR技术对菌株TF28具有特异性。优化的PMA处理条件为:PMA终浓度150μmol/L、暗培养10 min、光照20 min,在此条件下,可封闭10^(6)cfu/mL以下死菌基因组DNA;建立的PMA-qPCR技术特异性强,灵敏度高,最低检测限10^(2)cfu/mL;线性关系好,R^(2)=0. 997;在菌浓度10^(3)cfu/mL~10^(7)cfu/mL范围内重复性好,CT值变异系数小于2%,与平板活菌计数比较,差异不显著。[结论]建立的PMA-qPCR技术对TF28具有特异性,能够对菌浓度10^(3)cfu/mL~10^(7)cfu/mL活菌进行定量。 展开更多

关键词 Bacillus amyloliquefaciens TF28 pma-qpcr 活菌定量 特异性

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PMA-qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立 被引量：11

8

作者 王帅 徐进 +2 位作者 许景升 张昊 冯洁 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期122-128,135,共8页

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为1... 本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为10 min,曝光时间为5 min的PMA预处理体系。试验结果表明,当活菌比例大于10%,PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示,该方法适用于活菌数在5.0×10~2～5.0×10~8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。 展开更多

关键词 pma-qpcr 青枯菌 活菌检测

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橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系及应用 被引量：4

9

作者 官鑫 涂敏 +3 位作者 蔡海滨 王云月 曾霞 胡彦师 《广东农业科学》 CAS 2022年第5期102-109,共8页

【目的】橡胶树白粉病是迄今为止我国橡胶树最重要的叶部病害,通过将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,构建橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系,为及时高效检测橡胶树白粉菌分生孢子活菌量提供技术支撑。【方法】根据橡... 【目的】橡胶树白粉病是迄今为止我国橡胶树最重要的叶部病害,通过将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,构建橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系,为及时高效检测橡胶树白粉菌分生孢子活菌量提供技术支撑。【方法】根据橡胶树白粉菌核糖体内转录间隔区(ITS)序列保守区设计引物,验证其特异性,以该菌重组质粒pMD-19T-Eq绘制标准曲线,建立橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系,对其重复性和灵敏度进行评价,并运用该体系对丙环唑处理橡胶树白粉病病叶后的活菌数进行检测。【结果】研究设计的引物特异性良好,构建的橡胶树白粉菌qPCR标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9981,扩增效率为107.97%。PMA-qPCR对活孢子悬浮液扩增几乎无影响,检测灵敏度为4.77×10^(2) copies/μL。在丙环唑处理橡胶树白粉病15 min后,活菌比例从66.13%下降至23.18%。【结论】PMA-qPCR检测体系能快速定量检测橡胶树白粉病活菌量,具有灵敏、准确和高效的优点,为该病害的预测预报及防治效果提供理论依据和技术手段。 展开更多

关键词 橡胶树 白粉病 pma-qpcr技术 分生孢子 丙环唑

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PMA-qPCR快速检测结核活菌方法的建立 被引量：4

10

作者 温书香 王慧勤 +7 位作者 曹旭东 赵新霞 李亚 张亚丽 陈鹏博 纪太旺 陈创夫 袁莉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第2期143-147,共5页

为建立快速鉴别诊断结核活/死菌的方法,本研究应用PMA染料与实时定量PCR技术结合(PMA-qPCR),以结核标准株16 sRNA基因为靶基因,PMA对样品基因组提取物进行处理,PMA能够与死细胞DNA分子共价交联并抑制DNA分子扩增。结果显示:PMA浓度在3μ... 为建立快速鉴别诊断结核活/死菌的方法,本研究应用PMA染料与实时定量PCR技术结合(PMA-qPCR),以结核标准株16 sRNA基因为靶基因,PMA对样品基因组提取物进行处理,PMA能够与死细胞DNA分子共价交联并抑制DNA分子扩增。结果显示:PMA浓度在3μg/mL,曝光时间大于15 min时,PMA既不影响活菌的的扩增,又能有效抑制死菌的扩增;当PMA浓度大于20μg/mL时,PMA影响活菌DNA的扩增;PMA-qPCR技术能够定量不同比例的结核活/死菌悬液中的活菌。结论:PMA-qPCR技术能够快速准确检测出结核杆菌中的活细胞。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭(PMA) pma-qpcr技术 活 死菌

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3种死菌悬液制备方法对PMA-qPCR结果的影响 被引量：2

11

作者 王慧党 温书香 +2 位作者 王慧勤 曹旭东 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第12期15-19,共5页

本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法3种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法,比较不同灭菌方法制备的死菌对PMA-qPCR偶联技术结果的影响,选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌;... 本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法3种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法,比较不同灭菌方法制备的死菌对PMA-qPCR偶联技术结果的影响,选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌;探索PMA-qPCR偶联技术的适用范围和局限性。结果表明,热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆菌死菌悬液影响PMA-qPCR检测的Ct值的变化;紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对PMA-qPCR检测的Ct值没有影响;热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法;PMA-qPCR偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的检测。 展开更多

关键词 pma-qpcr偶联技术 热灭活 超声 紫外线照射

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黄瓜白粉病的PMA-qPCR方法建立及应用 被引量：2

12

作者 李金婷 张佐然 +3 位作者 梁雅静 孔维文 李云龙 何晓青 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2019年第5期550-555,共6页

鉴于叠氮溴化丙锭(PMA)染料可辨别细菌活性,将其与实时荧光定量PCR(qPCR)相结合,建立PMA-qPCR方法,以检测黄瓜白粉病的活性致病菌.在黄瓜白粉菌核糖体DNA的ITS区设计引物,将扩增片段重组到pGM-Simple-T载体中构建标准质粒.以5×10-5... 鉴于叠氮溴化丙锭(PMA)染料可辨别细菌活性,将其与实时荧光定量PCR(qPCR)相结合,建立PMA-qPCR方法,以检测黄瓜白粉病的活性致病菌.在黄瓜白粉菌核糖体DNA的ITS区设计引物,将扩增片段重组到pGM-Simple-T载体中构建标准质粒.以5×10-5×10^6个??μL^-1 6个梯度稀释质粒来绘制标准曲线,并做组内和组间重复.(1)qPCR标准曲线显示有良好的扩增结果,其相关系数(R2)为0.994.(2)利用qPCR检测臭氧处理后PMA染料处理组和对照组中有活性的黄瓜白粉菌数量.结果显示,PMA染料处理组拷贝数为4.335×10^2个??μL^-1,对照组拷贝数为9.448×10^6个??μL^-1.(3)利用PMA-qPCR方法检测臭氧处理后的黄瓜叶片不同部位(全组织、表面、内部)活菌数占总菌数的比例,处理50 min后的活菌比例分别较处理前下降了58.8%、67.0%、48.0%.这表明该方法可快速鉴定黄瓜白粉病中的活性致病菌数量,为该病的预防和控制提供技术支持. 展开更多

关键词 黄瓜白粉病 pma-qpcr 标准曲线 臭氧处理

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非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用 被引量：1

13

作者 卓玛 钱炳旭 +2 位作者 吴晓东 戴建君 薛峰 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第4期93-101,共9页

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特... 本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 多重pma-qpcr 基因缺失株 感染性病毒

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金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测 被引量：15

14

作者 田聪 余以刚 +3 位作者 肖性龙 吴晖 赖富饶 杨锡洪 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2013年第6期1390-1394,共5页

为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养(VBNC)状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明:8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌4... 为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养(VBNC)状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明:8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 活的非可培养状态 复苏 PMA 荧光定量PCR

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PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7 被引量：9

15

作者 李聪聪 余以刚 +3 位作者 邱杨 李美玲 肖性龙 吴晖 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第22期217-220,共4页

建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低... 建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭 定量PCR 活菌 检测

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PMA-qPCR快速检测畜禽肉类中沙门氏菌活菌方法的建立 被引量：5

16

作者 刘光富 马骉 +1 位作者 付贤树 俞晓平 《中国计量大学学报》 2018年第4期362-366,416,共6页

建立了一种将叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光定量PCR(qPCR)技术相结合的检测方法,用于定量检测畜禽肉类中活的沙门氏菌.通过优化光反应时间、PMA浓度等PMA作用条件,建立最优PMA-qPCR方法;同时构建重组质粒,并通过建立标准曲线考察该方法... 建立了一种将叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光定量PCR(qPCR)技术相结合的检测方法,用于定量检测畜禽肉类中活的沙门氏菌.通过优化光反应时间、PMA浓度等PMA作用条件,建立最优PMA-qPCR方法;同时构建重组质粒,并通过建立标准曲线考察该方法的灵敏度和特异性,然后将该方法用于定量检测未经增菌培养的畜禽肉类样品中的沙门氏菌.结果表明:在浓度12μg/mL、曝光时间6min的条件下,PMA的添加既不影响活菌的扩增,又能有效抑制死菌的扩增;采用PMA-qPCR检测人工染菌猪肉样品,最低可检出10CFU/mL沙门氏菌.该方法可快速、定量地检测畜禽肉类样品中的沙门氏菌. 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭 肠炎沙门氏菌 pma-qpcr方法 活菌

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PMA-qPCR检测十字花科黑斑病菌活菌方法的建立 被引量：4

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作者 于璇 王卫芳 +4 位作者 李献锋 冯黎霞 乾义柯 张承军 魏霜 《植物检疫》 2021年第4期49-54,共6页

利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光PCR技术相结合(PMA-qPCR),对PMA质量浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行优化,建立了检测十字花科黑斑病菌活菌的方法。结果显示,当PMA质量浓度为10μg/mL,避光条件下孵育5 min、然... 利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光PCR技术相结合(PMA-qPCR),对PMA质量浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行优化,建立了检测十字花科黑斑病菌活菌的方法。结果显示,当PMA质量浓度为10μg/mL,避光条件下孵育5 min、然后曝光10 min,此条件下能够抑制10-7CFU/mL十字花科黑斑病菌死菌的DNA扩增,对活菌扩增无影响,通过对比qPCR和PMA-qPCR的灵敏度可知,两者灵敏度差异不大,最低检出限均为10-3CFU/mL,将PMA-qPCR方法用于实际5批十字花科黑斑病菌阳性的油菜籽样品检测,结果显示该方法能准确反映实际样品的带活菌的情况。本研究为十字花科黑斑病菌活菌的检测提供了快速检测方法,可为实验室该病菌的快速筛检提供参考。 展开更多

关键词 十字花科黑斑病菌 pma-qpcr 活菌 检测

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乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立 被引量：8

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作者 盖冬雪 任洪林 +9 位作者 卢士英 胡盼 孟宪梅 刘熙 宋德刚 金雯 张嵩 常江 刘艳艳 柳增善 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期493-498,共6页

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法。优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理... 本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法。优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案。结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×108 CFU/mL的大肠杆菌经90℃水浴30s全部致死后,采用10μg/mL的PMA暗孵育15min后冰上曝光10min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×108 CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R2=0.9989,最低检测限为103 CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符。该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础。 展开更多

关键词 大肠杆菌 叠氮溴化丙啶 qPCR 计数

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乳品中的酵母活菌数PMA-qPCR检测方法的建立及初步应用 被引量：4

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作者 李畅 赵柯 +11 位作者 常江 张嵩 李萌 关玉婷 孟宪梅 柳增善 胡盼 任洪林 卢士英 李岩松 孙宇 刘熙 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2018年第22期128-132,共5页

本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列... 本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列扩增,以重组质粒pMD-18T-26S拷贝数对数与扩增循环数(Ct)值为坐标轴建立标准曲线,建立PMA-qPCR检测方法,并对实际样品中的酵母菌活菌富集后进行数量检测。PMA-q PCR法可达到国标规定的食品中酵母菌最高限量值1×10~2CFU/mL的检测标准,对应Ct值为36.67±0.43,重复性良好,总耗时6～7 h,可对酵母菌数量进行准确和快速的定量分析,为乳品中腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。 展开更多

关键词 乳品 PMA qPCR 酵母活菌计数

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PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究 被引量：7

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作者 肖妍 刘芸宏 +4 位作者 高贵田 曹凡 马燕萍 赵武奇 雷玉山 《食品与机械》 北大核心 2019年第4期48-53,59,共7页

将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13min... 将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13min可完全致死,Psa死菌浓度为1×10^7 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105μg/mL,最佳暗育时间为8min,最佳曝光时间为20min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.220 4x+37.73,R2=0.9955,最低可检出6.39×10^2拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×10^2拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×10^4 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符。 展开更多

关键词 PMA qPCR 猕猴桃溃疡菌 活菌检测

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