羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立 被引量：4

1

作者 梁倩 包涛涛 +6 位作者 鲜思美 杨倩 李鹏飞 顾庆林 郑维豪 杜鹏 青成欣 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第4期1524-1531,共8页

【目的】为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-... 【目的】为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】OrfV样本经60℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^(-1.68)TCID_(50)/0.1 mL。【结论】本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。 展开更多

关键词 羊口疮病毒(OrfV) pma-pcr 活性检测

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灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立 被引量：12

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作者 刘艳艳 柳增善 +6 位作者 卢士英 任洪林 盖冬雪 崔成 丁艳霞 孟宪梅 于师宇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第2期65-69,共5页

本试验旨在建立灭菌乳中活阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的PMA-PCR检测方法。将DNA染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术结合,优化PMA最佳工作浓度和曝光时间,确定PMA-... 本试验旨在建立灭菌乳中活阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的PMA-PCR检测方法。将DNA染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术结合,优化PMA最佳工作浓度和曝光时间,确定PMA-PCR区别死、活阪崎肠杆菌细胞的最佳条件。结果表明,活阪崎肠杆菌经100℃沸水处理20min可完全致死,PMA完全与死阪崎肠杆菌DNA共价交联并光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min,完全抑制死阪崎肠杆菌PCR扩增的最小PMA浓度为5μg/mL,不抑制活阪崎肠杆菌PCR扩增的最大PMA浓度为15μg/mL。经PMA处理后,在含有不同比例的死、活阪崎肠杆菌混合液中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为40CFU/mL,在灭菌乳样品中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为100CFU/mL。该方法为利用PMA-PCR检测食品中的活阪崎肠杆菌奠定了基础。 展开更多

关键词 PMA PCR 阪崎肠杆菌 灭菌乳

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PMA-PCR技术在植物病原细菌检疫中的应用前景 被引量：5

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作者 刘鹏 牛春敬 +3 位作者 胡佳续 冯洁 王金成 黄国明 《检验检疫学刊》 2014年第4期72-74,18,共4页

介绍了PMA-PCR技术检测活菌的方法,列举了该方法在食品、医疗和环境微生物检测领域的应用研究情况,并讨论了PMA-PCR技术在植物病原细菌检疫工作中的应用前景。

关键词 PMA—PCR 病原细菌 检疫

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山羊伪结核棒状杆菌PMA-PCR检测方法的建立 被引量：6

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作者 许国洋 付利芝 +3 位作者 龙小飞 陈朝洪 李鹏飞 张素辉 《现代畜牧兽医》 2018年第11期9-13,共5页

本试验旨在建立伪结核棒状杆菌的活菌检测方法,为临床检测及疫病防控提供理论依据。利用PMA可选择性穿透死菌细胞膜,在强光作用下与死菌DNA共价交联,阻止以其DNA为模板的PCR扩增这一原理,将PMA与PCR鉴定相结合,并对PMA最佳曝光时间、最... 本试验旨在建立伪结核棒状杆菌的活菌检测方法,为临床检测及疫病防控提供理论依据。利用PMA可选择性穿透死菌细胞膜,在强光作用下与死菌DNA共价交联,阻止以其DNA为模板的PCR扩增这一原理,将PMA与PCR鉴定相结合,并对PMA最佳曝光时间、最适工作浓度进行优化,建立伪结核棒状杆菌PMA-PCR活菌检测方法,并对其特异性进行分析。结果表明最佳曝光时间为15 min,PMA能够完全抑制死菌PCR扩增的最低浓度为20μmol/L,不抑制活菌PCR扩增的最大PMA浓度为30μmol/L。特异性试验结果显示,仅伪结核棒状杆菌可扩增出目的条带,而在链球菌、多杀性巴氏杆菌中未扩增出目的条带。对不同比例的死/活菌检测发现,该方法可以有效针对活菌进行检测,活菌的最低检测浓度为1×104 cfu/mL。本研究为伪结核棒状杆菌的活菌检测提供了一定的理论依据,也为由伪结核棒状杆菌诱发的山羊疫病防控奠定了基础。 展开更多

关键词 伪结核棒状杆菌 PMA PCR活细菌检测 共价交联

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PMA-PCR诊断技术研究进展

5

作者 石艳萍 陈弟诗 +5 位作者 王印 陈斌 杨悦 张鹏飞 李春 邵靓 《中国动物检疫》 CAS 2023年第3期72-78,共7页

叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种光反应的DNA结合染料,具有极高的DNA亲和结合能力。PMA可进入死亡和外膜损伤严重的微生物内部,插入DNA结构中,经可见光刺激发生光裂解后,同DNA结合发生共价交联反应,共价交联产物可以抑制DN... 叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种光反应的DNA结合染料,具有极高的DNA亲和结合能力。PMA可进入死亡和外膜损伤严重的微生物内部,插入DNA结构中,经可见光刺激发生光裂解后,同DNA结合发生共价交联反应,共价交联产物可以抑制DNA的PCR扩增。基于PMA的这一特性,PMAPCR可用于鉴别活死细菌、真菌、病毒等微生物。在实际应用中,PMA-PCR检测结果受样本浊度、活死微生物比例、PMA浓度、暗处理条件(温度、暗处理时间)、曝光条件(光源、光处理时间)、样本处理方法以及目的基因扩增长度等多种因素影响。PMA-PCR已被应用于动植物疫病防控、食品安全、公共卫生等多个领域,具有广阔的应用前景。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭 PMA PCR 检测

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发酵乳中活性益生菌三重数字PCR定量检测方法的建立

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作者 赵磊 刘洋 +3 位作者 凌李维 柳鑫燕 赵渝 吴浩 《中国乳品工业》 北大核心 2025年第1期73-80,共8页

益生菌发酵乳是益生菌市场发展的重要赛道,精确定量产品中活性益生菌对保障其营养功能至关重要。文章以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)为研... 益生菌发酵乳是益生菌市场发展的重要赛道,精确定量产品中活性益生菌对保障其营养功能至关重要。文章以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)为研究对象,采用种特异性引物和探针,结合叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染色,基于芯片式数字PCR技术建立了发酵乳中活性益生菌的三重定量检测方法。结果表明,3组引物和探针均能特异性扩增目标菌株,无交叉反应,且20μg/mL的PMA能够有效抑制嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌死菌DNA的扩增。该检测方法对嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的灵敏度分别为1.65、2.20、2.16 copies/μL,重复性检测的相对标准偏差为1.52%~8.69%,成功实现了对发酵乳中3种常见益生菌的活菌定量检测。为益生菌发酵乳中活菌检测的标准化提供了技术支持和科学依据。 展开更多

关键词 发酵乳 PMA 种特异性 芯片式数字PCR

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PMA-qPCR定量检测饮用水中铜绿假单胞菌的方法

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作者 张瑞停 王园媛 +2 位作者 邢方潇 张晓 张岚 《净水技术》 2025年第5期206-215,共10页

【目的】为预防水源性疾病暴发和保障水质安全,建立快速、准确的检测水中活性病原菌的方法至关重要。鉴于生活饮用水细菌含量较低,建立一种适用于大体积饮用水中铜绿假单胞菌检测的富集浓缩及叠氮溴化丙锭-定量聚合酶链式反应(PMA-qPCR... 【目的】为预防水源性疾病暴发和保障水质安全,建立快速、准确的检测水中活性病原菌的方法至关重要。鉴于生活饮用水细菌含量较低,建立一种适用于大体积饮用水中铜绿假单胞菌检测的富集浓缩及叠氮溴化丙锭-定量聚合酶链式反应(PMA-qPCR)方法。【方法】通过调整涡旋振荡时长,计算加标回收率,优化富集浓缩方法;采用L_(16)(4^(3))正交试验筛选能够有效去除铜绿假单胞菌死菌脱氧核糖核酸的PMA处理条件的最佳组合,并进行验证。【结果】通过膜过滤法将10 L饮用水中的铜绿假单胞菌富集至膜上后,采用涡旋振荡(转速为3000 r/min,振荡时间为15 min,重复2次)及离心(8000 g,10 min)的方式将膜上的细菌洗脱至1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。该方法在50 min内完成且回收率可达80.95%±7.43%。PMA-qPCR法的最优PMA处理条件:PMA浓度为30μmol/L、黑暗中孵育时间为20 min、光暴露时间为20 min。该方法与平板计数法的检测结果一致,可有效抑制死菌DNA的扩增。活菌数与PMA-qPCR扩增循环数为1×10^(2)~1×10^(6)CFU/mL时呈现良好的线性关系(R2=0.99),建立的标准曲线方程(y=-3.541x+44.11)可定量检测活菌数量。PMA-qPCR法定量限为1×10^(2)CFU/mL,且结合富集的方式,灵敏度可被提高1×10^(4)倍。【结论】该研究建立的检测方法适用于10 L大体积饮用水中铜绿假单胞菌活菌的定量分析,为后续深入研究提供了有效的技术手段。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 叠氮溴化丙锭(PMA) 荧光定量聚合酶链式反应(PCR) 活菌计数 饮用水

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马铃薯青枯病病菌PMA-PCR活菌检测体系优化与初步应用 被引量：5

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作者 高达芳 刘霞 杨艳丽 《中国植保导刊》 北大核心 2017年第10期5-13,共9页

应用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立一种有效快速检测包括活的非可培养状态(Viable But Non-Culturable,VBNC)在内的马铃薯青枯菌活菌的方法。根据青枯菌lpxC基因序列设计特异性引物lpxC5a/6a,探究不同PMA浓度、曝光时间对浓度... 应用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立一种有效快速检测包括活的非可培养状态(Viable But Non-Culturable,VBNC)在内的马铃薯青枯菌活菌的方法。根据青枯菌lpxC基因序列设计特异性引物lpxC5a/6a,探究不同PMA浓度、曝光时间对浓度为1×10~9 cfu/m L的热致死菌悬液中死亡菌体抑制效果的影响,确定PMA最佳处理方案,对采自云南地区的19份田间土样中的包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测。结果显示,引物lpx C5a/6a可特异性扩增青枯菌而产生304 bp的条带。当样品中PMA终浓度为40μmol/L,650 W卤素灯曝光15 min,PMA可有效抑制死亡菌体的扩增,而对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌的扩增没有影响。在19份田间土样检测中,有7份土样检测出存在青枯活菌。 展开更多

关键词 马铃薯青枯病病菌 叠氮溴化丙锭(PMA) PCR

原文传递

肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PCR检测研究 被引量：7

9

作者 祝儒刚 宋立峰 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第16期199-203,共5页

将荧光染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门... 将荧光染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PMA-PCR检测方法。结果表明:使插入死细胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min;不抑制沙门氏菌活细胞DNA扩增的最大PMA质量浓度为10μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小PMA质量浓度为4μg/mL。经PMA处理,含有不同比例的沙门氏菌热致死细胞和活细胞的混合液中活的沙门氏菌能够通过PCR被选择性的检测,最小检测限为20CFU/PCR。而且,经研究发现在20～2×105CFU/PCR范围内,电泳条带相对荧光强度与活细胞数的对数具有线性关系。采集30份肉及肉制品样品,利用PMA-PCR方法检测出两份生肉样品中存在沙门氏菌,经过6h的富集培养后的活菌浓度分别为2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。 展开更多

关键词 肉及肉制品 沙门氏菌 活细胞 pma-pcr

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基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究 被引量：12

10

作者 仝铁铮 吴舒旭 +3 位作者 李丹 何苗 杨天 施汉昌 《环境科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第4期1120-1126,共7页

建立了一种核酸染料propidium monoazide(PMA)与定量PCR技术联合选择性检测活性病原菌的技术(PMA-qPCR),以大肠杆菌作为模式菌,研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性.结果表明,PMA染料能够分别去除99.94%和99.99%的来自非活性大肠杆... 建立了一种核酸染料propidium monoazide(PMA)与定量PCR技术联合选择性检测活性病原菌的技术(PMA-qPCR),以大肠杆菌作为模式菌,研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性.结果表明,PMA染料能够分别去除99.94%和99.99%的来自非活性大肠杆菌和沙门氏菌的DNA,PMA-qPCR技术能够有效区分活性菌与非活性菌;PMA-qPCR技术得到的氯和一氯胺消毒对大肠杆菌的灭活曲线符合一级动力学方程,灭活速率常数分别为2.24 L.(mg.min)-1和0.017 5 L.(mg.min)-1,低于平板培养法得到的灭活速率常数;当大肠杆菌的去除率达到99%时,采用PMA-qPCR技术检测需要的ct值相比于平板培养法从0.6 mg.L-1.min上升到0.9 mg.L-1.min(氯消毒)和从20 mg.L-1.min上升到超过100 mg.L-1.min(一氯胺消毒);随着ct值的升高,常规qPCR的检测结果基本不变,因此常规qPCR不能够反映氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.作为一种新的表征消毒特性的检测技术,PMA-qPCR技术有助于更为准确地评价氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果. 展开更多

关键词 PMA染料 定量PCR 活性菌 氯消毒 一氯胺消毒 灭活特性

原文传递

创伤弧菌PMA RTi-PCR检测技术的建立 被引量：9

11

作者 张晶 周勇 +1 位作者 陶霞 吴新伟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期54-58,共5页

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(RTi-PCR)技术相结合,建立以一种快速准确的创伤弧菌检测方法。方法以vvh基因作为检测创伤弧菌的靶基因,用PMA对样品基因组提取进行前处理,抑制该DNA分子的RTi-PC... 目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(RTi-PCR)技术相结合,建立以一种快速准确的创伤弧菌检测方法。方法以vvh基因作为检测创伤弧菌的靶基因,用PMA对样品基因组提取进行前处理,抑制该DNA分子的RTi-PCR扩增。结果终浓度为3.0mg/L的PMA可有效抑制死细胞(1×108 CFU/mL)DNA的扩增;当PMA浓度小于或等于5.0mg/L时,对创伤弧菌DNA的扩增没有显著的影响;含有不同比例死活细菌的创伤弧菌混合液RTi-PCR结果表明,PMA RTi-PCR能选择性定量创伤弧菌中的活菌。纯培养创伤弧菌活细胞的检测灵敏度检测极限为2.5×101 CFU/mL,并且Ct值与细胞数的对数呈良好的线性关系,相关系数R2值为0.9982。结论 PMA RTi-PCR是一种快速灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。 展开更多

关键词 创伤弧菌 PMA RTi-PCR 死活细菌

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PMA结合ddPCR检测食品中金黄色葡萄球菌的研究 被引量：16

12

作者 赵丽青 王静 +4 位作者 秦燕 贾俊涛 姜英辉 唐静 张健 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期105-109,共5页

研究了将叠氮溴化丙锭(PMA)与微滴式数字PCR(ddPCR)技术相结合,用于金黄色葡萄球菌活菌的检测。结果表明,强烈光照15 min,可以使PMA与死菌DNA共价交联,同时钝化游离的PMA;可以有效抑制金黄色葡萄球菌死菌DNAPCR扩增的PMA终浓度为2.0μg/... 研究了将叠氮溴化丙锭(PMA)与微滴式数字PCR(ddPCR)技术相结合,用于金黄色葡萄球菌活菌的检测。结果表明,强烈光照15 min,可以使PMA与死菌DNA共价交联,同时钝化游离的PMA;可以有效抑制金黄色葡萄球菌死菌DNAPCR扩增的PMA终浓度为2.0μg/m L;不抑制活菌DNA扩增的PMA最高浓度是5.0μg/m L。在不同死、活菌比例下,PMA-ddPCR可以定量检测活菌,避免了死菌DNA的干扰,本方法的检出限为10 copy/20μL。利用PMA-ddPCR检测人工污染鸡肉样品,最低可检出102cfu/m L的金黄色葡萄球菌。表明PMA-ddPCR方法的灵敏度高。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭 微滴式数字PCR 金黄色葡萄球菌

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荧光定量PCR结合EMA/PMA染色法快速检测军团菌活菌 被引量：6

13

作者 赵红波 熊丽娜 莫自耀 《中国卫生检验杂志》 CAS 北大核心 2013年第7期1661-1664,共4页

目的:利用EMA/PMA经膜核酸染色结合荧光定量PCR技术快速检测军团菌活菌,比较两者的检测效率。方法:军团菌分别经加热灭活和氯消毒剂灭活,加入EMA/PMA处理,确定EMA/PCR、PMA/PCR体系和反应条件,之后进行快速检测。利用BacLight Live/Dead... 目的:利用EMA/PMA经膜核酸染色结合荧光定量PCR技术快速检测军团菌活菌,比较两者的检测效率。方法:军团菌分别经加热灭活和氯消毒剂灭活,加入EMA/PMA处理,确定EMA/PCR、PMA/PCR体系和反应条件,之后进行快速检测。利用BacLight Live/Dead bacterial viability kit验证活菌,同时用培养法做比对。结果:EMA和PMA工作浓度分别为0μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,将菌液与之混合后用卤素灯照射,时间分别为0 min,1 min,5 min,15 min,经测试确定EMA工作浓度为50μg/ml,而PMA为25μg/ml,光照时间选用15 min。模拟环境样本检测,EMA/PMA real-time PCR检测限均为104cfu/ml,但培养法PMA处理后平板上菌落多于EMA处理组。结论:EMA/PMA real-time PCR可快速检测军团菌活菌,检测效率相当(均低于不加染料组),PMA效果优于EMA。 展开更多

关键词 荧光定量PCR EMA PMA 军团菌 活菌

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实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究 被引量：14

14

作者 王晓冲 周继昌 +2 位作者 李军 王晓炜 应国红 《中国现代应用药学》 CAS CSCD 2013年第12期1333-1337,共5页

目的建立应用实时荧光定量PCR进行无菌快速检测的方法。方法选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用裂解试剂盒抽提细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR检测,并应用叠氮溴化丙锭(PMA)抑制样品中死菌基因组DNA的PCR扩增。结果 PMA能有效去除... 目的建立应用实时荧光定量PCR进行无菌快速检测的方法。方法选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用裂解试剂盒抽提细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR检测,并应用叠氮溴化丙锭(PMA)抑制样品中死菌基因组DNA的PCR扩增。结果 PMA能有效去除样品中死菌干扰,针对16S rRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度。在金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌检测中,最低含菌量组与阴性对照组Ct值有明显差异(P<0.05),其最低检出限为2 CFU/PCR。在对人工污染药品的无菌检测中,该方法与药典检测方法结果一致。结论进行无菌检查时,采用PMA去除样品中死菌基因组DNA干扰,以裂解试剂盒抽提细菌基因组后用荧光定量PCR分析样品中细菌污染,可将检测时间缩短到4 h左右,操作简单,灵敏性高,可应用于药品无菌检查的快速筛查。 展开更多

关键词 荧光定量PCR 叠氮溴化丙锭 细菌污染 快速检

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不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析 被引量：3

15

作者 刘羽霏 方祥 +2 位作者 廖振林 王丽 钟青萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第20期215-221,共7页

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative po... 定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。 展开更多

关键词 副溶血弧菌 活的非可培养(VBNC)状态 PMA-qPCR 流式细胞仪 激光扫描共聚焦显微镜

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血管紧张素Ⅱ对巨噬细胞表达肿瘤坏死因子转化酶的影响 被引量：1

16

作者 吴超能 蒲晓群 +2 位作者 方崇峰 江建军 唐礼江 《中国动脉硬化杂志》 CAS CSCD 2007年第3期197-200,共4页

目的研究血管紧张素Ⅱ对经佛波酯分化的人急性白血病单核细胞表达肿瘤坏死因子转化酶mRNA的影响,探讨两者之间的联系,以进一步了解它们在动脉粥样硬化中的地位。方法将不同浓度血管紧张素Ⅱ(10-10～10-7mol/L)与经佛波酯(40nmol/L)分化... 目的研究血管紧张素Ⅱ对经佛波酯分化的人急性白血病单核细胞表达肿瘤坏死因子转化酶mRNA的影响,探讨两者之间的联系,以进一步了解它们在动脉粥样硬化中的地位。方法将不同浓度血管紧张素Ⅱ(10-10～10-7mol/L)与经佛波酯(40nmol/L)分化后的人急性白血病单核细胞共孵育24h,以及将血管紧张素Ⅱ(10-7mol/L)与细胞作用不同时间(0、6、12、24和48h),采用半定量逆转录—聚合酶链反应法检测肿瘤坏死因子转化酶mRNA表达的情况。结果经佛波酯诱导后,人急性白血病单核细胞分化为巨噬细胞并表达肿瘤坏死因子转化酶mRNA。不同浓度的血管紧张素Ⅱ作用细胞24h,肿瘤坏死因子转化酶mRNA的表达呈浓度依赖性增加,差异具有显著性。血管紧张素Ⅱ(10-7mol/L)作用于细胞,呈时间依赖性诱导肿瘤坏死因子转化酶mRNA的表达,6h开始增加,24h达峰,之后逐渐减低,差异具有显著性。结论经佛波酯诱导分化后的人急性白血病单核细胞表达肿瘤坏死因子转化酶;血管紧张素Ⅱ呈浓度和时间依赖性上调巨噬细胞肿瘤坏死因子转化酶mRNA表达。血管紧张素Ⅱ与肿瘤坏死因子转化酶可能共同参与了血管壁炎症和动脉粥样硬化进展。 展开更多

关键词 病理与病理生理学 动脉粥样硬化 炎症 血管紧张素Ⅱ 佛波酯 巨噬细胞 肿瘤坏死因子转化酶 逆转录-聚合酶链反应

暂未订购

梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立 被引量：15

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作者 袁英哲 韩剑 +4 位作者 王岩 罗明 包慧芳 张春竹 黄伟 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1425-1433,共9页

【目的】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌(Erwinia... 【目的】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×10^8 CFU·mL^-1、PMA浓度为25μmol·L^-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%~100%时(浓度为6.0×10^7~6.0×10^8 CFU·mL^-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R^2=0.9928)。灵敏度检测结果表明,6.0×10^3~6.0×10^8 CFU·mL^-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R^2=0.9947),检测灵敏度下限为6×10^3 CFU·mL^-1(12 CFU/qPCR反应)。用建立的PMAqPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”。 展开更多

关键词 梨火疫病菌 叠氮溴化丙啶(PMA) 实时荧光定量PCR(qPCR) 活菌

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水产品中副溶血性弧菌PMA-dd PCR活菌定量检测方法的研究 被引量：8

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作者 翁文川 管锦绣 +4 位作者 谢会 凌莉 陈文锐 冼钰茵 许喜林 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2019年第6期273-279,190,共8页

本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法。基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tl... 本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法。基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tlh基因为目的片段设计及筛选适合的特异性引物与探针,优化反应体系,通过对PMA浓度及曝光条件等优化,建立了一种联用PMA-ddPCR技术快速检测水产品中活的副溶血性弧菌的定量检测方法。研究结果显示:选择16μg/mL作为PMA工作浓度,曝光时间为8min,此条件下能够完全抑制副溶血性弧菌死菌的DNA扩增并对活菌扩增无影响。通过对比PMA-ddPCR和PMA-qPCR的检测低限分别为2×10^1cfu/mL、2×10^2cfu/mL,PMA-ddPCR法的灵敏度比PMA-qPCR法的高。应用PMA-ddPCR定量方法检测人工污染的基围虾和小帆立贝这两种海产品,在基围虾中最低可检出1.9×10^1cfu/g的副溶血性弧菌、在小帆立贝中最低可检出8.9cfu/g的副溶血性弧菌。该研究为将PCR技术实际应用于水产品中低量污染、活的副溶血性弧菌的定量检测奠定了基础。 展开更多

关键词 副溶血性弧菌 叠氮溴化丙锭 微滴式数字PCR

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PMA-qPCR技术在发酵食品活菌计数中的应用 被引量：9

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作者 陈卓君 魏铭 +4 位作者 林果 陈昱锜 梁杉 张柏林 朱保庆 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期242-248,共7页

发酵食品具有丰富的口感和较高的营养价值,深受广大消费者喜爱。准确计数发酵食品生产加工与贮藏过程中的活菌,是对产品进行质量控制、评价以及工艺改进的基础。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种具有高亲和力的光敏性DNA结... 发酵食品具有丰富的口感和较高的营养价值,深受广大消费者喜爱。准确计数发酵食品生产加工与贮藏过程中的活菌,是对产品进行质量控制、评价以及工艺改进的基础。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种具有高亲和力的光敏性DNA结合染料,用于处理样品后偶联使用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)计数可极大缩短检测时长且灵敏度高、特异性强。该文综述PMA-qPCR技术的原理、影响因素及其在红酒、啤酒、酸奶等发酵食品活菌计数中的应用现状。将目标微生物及PMA处理条件列为此技术影响因素,以此为基础总结各类发酵食品中可检测微生物及检测线性范围及检测限,为扩大此方法使用范围,获取发酵食品中更为丰富和精准的活菌检测结果提供参考。 展开更多

关键词 发酵食品 活菌计数 叠氮溴化丙锭 实时荧光定量PCR

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叠氮溴化丙锭结合实时荧光定量PCR技术检测发酵乳中植物乳杆菌P-8活菌数 被引量：8

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作者 韩之皓 郭帅 +5 位作者 黄天 郑岩 王月娇 白梅 王记成 张和平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期183-189,共7页

采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合实时荧光定量PCR对乳制品中活菌DNA进行定量分析,建立一种快速而准确检测发酵乳品中植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8)活菌数的新方法。通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝... 采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合实时荧光定量PCR对乳制品中活菌DNA进行定量分析,建立一种快速而准确检测发酵乳品中植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8)活菌数的新方法。通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行试验,确定最佳PMA处理方案。结果表明:L. plantarum P-8经80℃处理60 s,即为膜损伤菌;当PMA质量浓度为40μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间为20 min时,PMA既不影响活菌DNA的PCR扩增,又能渗透进入细胞膜受损的死菌并抑制其PCR扩增;通过制备L.plantarum P-8质粒标准品并建立标准曲线,其表现出良好的线性关系,相关系数(R2)为0. 992 9,最低检测限为103CFU/m L,特异性良好。该方法为完善发酵乳产品益生菌活菌数的检测奠定了基础。 展开更多

关键词 植物乳杆菌 叠氮溴化丙锭(propidium monoazide PMA) 实时荧光定量PCR

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