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Cloning and Expression of PKR Gene of Ctenopharyngodon idellus Induced by PolyI:C in vitro
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作者 李景芬 刘莉 曹访 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2011年第12期1943-1945,1961,共4页
[Objective] The study aimed at cloning PKR gene from Ctenopharyngodon idellus induced by PolyI:C in vitro,so as to provide foundation for study on the anti-virus genes of C.idellus.[Method] By referring to the PKR ge... [Objective] The study aimed at cloning PKR gene from Ctenopharyngodon idellus induced by PolyI:C in vitro,so as to provide foundation for study on the anti-virus genes of C.idellus.[Method] By referring to the PKR gene sequences of zebra fish(AJ852023.1) and Carassius auratus(AY293929.1) in Genbank,three pairs of degenerate primers were designed with Primer Premier 5.0 software;in vitro C.idellus kidney cells(CIK) were treated with 100 μg/ml of Poly I:C for 12,36 and 48 h,and then total RNA of the cells treated was extracted for amplifying the PKR gene by RT-PCR.[Result] The PKR gene was amplified from the cells treated with Poly I:C for 36 and 48 h,but not from the cells treated for 12 h;in addition,the expression level increased with the processing time.Part of the amplified sequence of C.idellus shared the homology of 100% and 81.48% with the sequences of carp and zebra fish separately.[Conclusion] Part of the PKR gene sequence was cloned successfully from C.idellus.Moreover,we have proved that PolyI:C induction is effective for PKR protein expression,which will provide reference for treating viral diseases of C.idellus. 展开更多
关键词 PolyI:C pkr Ctenopharyngodon idellus CLONE expression
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AduoLa Fuzhenglin Down-regulates Microwave-induced Expression of β_1-adrenergic Receptor and Muscarinic Type 2 Acetylcholine Receptor in Myocardial Cells of Rats 被引量:9
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作者 ZHANG Jing PENG Rui Yun +7 位作者 GAO Ya Bing WANG Shui Ming YANG Lei Lei ZHAO Li DONG Ji YAO Bin Wei CHANG Gong Min XIONG Lu 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2014年第3期204-207,共4页
This paper is aimed to study the effect of ADL on expression of ~z-AR and Mz-AchR in myocardial cells of rats exposed to microwave radiation. Immunohistochemistry, Western blot and image analysis were used to detect t... This paper is aimed to study the effect of ADL on expression of ~z-AR and Mz-AchR in myocardial cells of rats exposed to microwave radiation. Immunohistochemistry, Western blot and image analysis were used to detect the expression of ~I-AR and Mz-AchR in myocardial cells at 7 and 14 d after microwave exposure. The results show that the expression level was higher in microwave exposure group and 0.75 g/(kg.d) ADL group than in sham operation group and significantly lower in 1.5 and 3.0 g/(kg.d) ADL groups than in microwave group. So we have a conclusion that the expression of I^z-AR and Mz-AchR is down-regulated in myocardial cells of rats exposed to microwave radiation. ADL can protect rats against microwave-induced heart tissue injury. 展开更多
关键词 AchR AduoLa Fuzhenglin down-regulates Microwave-induced expression of adrenergic Receptor and Muscarinic Type 2 Acetylcholine Receptor in Myocardial Cells of Rats
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Maternal Lead Exposure Induces Down-regulation of Hippocampal Insulin-degrading Enzyme and Nerve Growth Factor Expression in Mouse Pups
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作者 LI Xing LI Ning +6 位作者 SUN Hua Lei YIN Jun TAO Yu Chang MAO Zhen Xing YU Zeng Li LI Wen Jie John D BOGDEN 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2017年第3期215-219,共5页
Lead exposure is a known potential risk factor for neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD). Exposure to lead during the critical phase of brain development has been linked with mental retardatio... Lead exposure is a known potential risk factor for neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD). Exposure to lead during the critical phase of brain development has been linked with mental retardation and hypophrenia in later life. 展开更多
关键词 AD Maternal Lead Exposure Induces down-regulation of Hippocampal Insulin-degrading Enzyme and Nerve Growth Factor expression in Mouse Pups IDE NGF
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Down-regulation of Notch-1 gene expression inhibits growth of TJ-905 glioblastoma
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作者 王建鹏 《外科研究与新技术》 2011年第3期205-206,共2页
Objective To study the inhibitory effect of siRNA on glioblastoma (GBM) Notch-1 gene expression in addition to the growth of TJ-905 glioblastoma. Methods Three small interference RNAs (siRNAs) targeting Notch1 gene,na... Objective To study the inhibitory effect of siRNA on glioblastoma (GBM) Notch-1 gene expression in addition to the growth of TJ-905 glioblastoma. Methods Three small interference RNAs (siRNAs) targeting Notch1 gene,named siRNA1,siRNA2,siRNA3,synthesized chemically in vitro with gene bank BLAST. TJ-905 cells were transfected twice with the siRNA by using Oligofectamine 展开更多
关键词 siRNAs gene down-regulation of Notch-1 gene expression inhibits growth of TJ-905 glioblastoma
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PolyI:C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达 被引量:4
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作者 李景芬 刘莉 曹访 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第33期20514-20516,20529,共4页
[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼(AJ852023.1)和鲫鱼(AY293929.1)的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI:C体外分别处理草鱼肾细胞(Ctenop... [目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼(AJ852023.1)和鲫鱼(AY293929.1)的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI:C体外分别处理草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK)12、36、48 h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因。[结果]处理12 h时未扩增出PKR基因,处理36和48 h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI:C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。 展开更多
关键词 PolyI:C pkr 草鱼 克隆 表达
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PKR基因表达高效阻断Marc-145细胞系建立及其对PRRSV增殖的影响 被引量:1
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作者 肖跃强 杨慧 +5 位作者 于雪 王文秀 孙培姣 魏凤 唐娜 沈志强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1535-1540,共6页
研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶R(interferon-induced,double-stranded RNA-activated kinase,PKR)下调表达状态下的感染特性。以Macr-145细胞PKR基因序列设计... 研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶R(interferon-induced,double-stranded RNA-activated kinase,PKR)下调表达状态下的感染特性。以Macr-145细胞PKR基因序列设计3个shRNA,并设阳性对照,合成后插入pSilencer^(TM)2.1-U6载体构建重组质粒,与Macr-145细胞PKR+EGFP标签融合表达的重组质粒共转染HEK293细胞,以筛选能下调表达PKR的shRNA,并将该shRNA重组质粒转染Marc-145细胞,潮霉素B抗性筛选并克隆纯化获得PKR下调表达的细胞系,感染重组病毒PRRSV XZ06a-EGFP,通过检测病毒结构蛋白M与EGFP表达、观察细胞病变等,研究此状态下感染特性。结果显示筛选获得致使PKR下调表达的shRNA,以及稳定表达shRNA、PKR表达降低90%以上的Marc-145细胞系,重组病毒感染后48h,M蛋白与EGFP表达均受到抑制,且与对照相比,感染后72~96 h,未观察到典型的细胞病变效应,说明在PKR表达受到抑制时,病毒增殖受到明显抑制。本研究通过建立PKR下调表达细胞系与PRRSV感染试验,初步阐明PKR在PRRSV增殖时所发挥的作用,为进一步开展PRRSV与细胞抗病毒固有免疫互作机制研究莫定了基础。 展开更多
关键词 MARC-145细胞 pkr下调表达shRNA PRRSV
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双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定 被引量:2
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作者 关振宏 李影 +1 位作者 张茂林 段铭 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第28期13521-13523,共3页
[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体... [目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定。[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69 kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化。[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 流感病毒 双链RNA依赖的蛋白激酶 真核表达 纯化
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猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达
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作者 孙岩 胡健 +5 位作者 温俊歌 郜原 薄联锋 徐志坤 吴耀丽 张德礼 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2011年第9期1-6,共6页
【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接... 【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。 展开更多
关键词 pkr基因 克隆 原核表达 真核表达
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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)双链RNA依赖的蛋白激酶R(PKR)基因克隆和实时定量表达分析
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作者 沙珍霞 王启龙 +3 位作者 李敏 公光业 梁卓 陈松林 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期1024-1032,共9页
采用RACE方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)PKR基因(CsPKR),获得了CsPKR全长cDNA序列为2907bp,其中包含1959bp的开放阅读框,100bp的5′非编码区和848bp的3′非编码区。保守结构域分析显示推导的CsPKR氨基酸在N端存在两个特异... 采用RACE方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)PKR基因(CsPKR),获得了CsPKR全长cDNA序列为2907bp,其中包含1959bp的开放阅读框,100bp的5′非编码区和848bp的3′非编码区。保守结构域分析显示推导的CsPKR氨基酸在N端存在两个特异的dsRBD(dsRNA binding domain dsRBD)结构域,在C端具有多个保守的激酶活性位点,包括ATP结合位点和底物配体结合位点,以及活性环结构A-loop。系统进化树分析显示鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类的PKR具有共同的进化起源,CsPKR与牙鲆PKR的亲缘关系最为密切。荧光定量PCR结果显示,CsPKR基因在健康鱼多个组织中广泛表达,在脑中的表达最高,头肾中表达最低。经鳗弧菌和淋巴囊肿病毒分别感染后,CsPKR基因在免疫相关组织中呈现上调表达趋势,其中感染鳗弧菌12h后在血液中表达量较对照组上升了9.28倍,在感染淋巴囊肿病毒24h后,在肝脏中的表达达到最大,为对照组的9.97倍。以上结果暗示CsPKR基因在半滑舌鳎响应细菌和病毒免疫应答中起重要作用。 展开更多
关键词 半滑舌鳎 pkr基因 克隆 病原 基因表达分析
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蛋白激酶PKR在HeLa细胞中的过表达及其siRNA干扰的鉴定
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作者 吴娜 赵志荀 +7 位作者 吴国华 颜新敏 叶奕优 李应国 朱海霞 李健 张志东 张强 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第5期43-47,共5页
为了研究双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)信号通路对羊痘病毒复制的影响,试验构建了PKR基因的真核表达载体,并在He La细胞中实现了PKR的过表达;从相关文献中筛选了靶向PKR的2对siRNA,检测其对PKR的干扰效果,以RT-PCR方法扩增PKR基因,克隆入... 为了研究双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)信号通路对羊痘病毒复制的影响,试验构建了PKR基因的真核表达载体,并在He La细胞中实现了PKR的过表达;从相关文献中筛选了靶向PKR的2对siRNA,检测其对PKR的干扰效果,以RT-PCR方法扩增PKR基因,克隆入表达载体pc DNA3.1(-)/Myc-His(B),对重组质粒进行双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒或siRNAs分别转染He La细胞,Western-blot检测PKR蛋白的表达水平。结果表明:试验成功构建了PKR基因的真核表达载体pc DNA3.1(-)-PKR,重组质粒在He La细胞中得到了表达;2对siRNA具有较好的干扰效果,其中siRNA1、siRNA2对PKR的干扰效率分别达到76%和52%。 展开更多
关键词 羊痘病毒 pkr基因 真核表达 SIRNA HELA细胞
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CaPKR-like在鲫鱼与草鱼组织中的表达特性分析 被引量:7
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作者 彭悟 汤雅男 胡成钰 《Zoological Research》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期465-469,共5页
PKR是由干扰素诱导的最重要的抗病毒蛋白之一,能抑制细胞和病毒蛋白的合成。鲫鱼PKR基因(CaPKR-like)是鱼类第一个,也是非哺乳类脊椎动物第一个报道的PKR全长cDNA序列。本研究制备了CaPKR-like N-端包含Zα结构域的多克隆抗体,采用Weste... PKR是由干扰素诱导的最重要的抗病毒蛋白之一,能抑制细胞和病毒蛋白的合成。鲫鱼PKR基因(CaPKR-like)是鱼类第一个,也是非哺乳类脊椎动物第一个报道的PKR全长cDNA序列。本研究制备了CaPKR-like N-端包含Zα结构域的多克隆抗体,采用Western blots检验PKR-like在鲫鱼和草鱼组织中的表达特性。Western blots显示在未诱导的鲫鱼和草鱼中该基因表达水平非常低,但是经Poly I:C免疫一周后,在鲫鱼和草鱼等8种组织中有较强的PKR-like蛋白产生。结果暗示:CaPKR-like与哺乳类PKR有相同的组织表达特性。 展开更多
关键词 pkr Capkr—like 表达 鲫鱼 草鱼
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禽源PKR基因生物信息学及组织表达分析
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作者 任红玉 谢芝勋 +10 位作者 华骏 万丽军 王盛 谢丽基 谢志勤 范晴 罗思思 张艳芳 黄娇玲 曾婷婷 张民秀 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第24期79-84,150,151,共8页
为了探讨禽源双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)基因的分子生物学特征并了解其在鸡组织/器官中的表达分布情况,试验首先利用生物信息学在线工具对编码蛋白进行了理化性质分析及二级结构、三级结构预测;然后将禽源PKR基因插入至真核表达载体p... 为了探讨禽源双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)基因的分子生物学特征并了解其在鸡组织/器官中的表达分布情况,试验首先利用生物信息学在线工具对编码蛋白进行了理化性质分析及二级结构、三级结构预测;然后将禽源PKR基因插入至真核表达载体pEF1α-Myc中,将重组真核表达载体pEF1α-Myc-PKR转染至DF1细胞中,通过间接免疫荧光鉴定和Western-blot鉴定对表达的蛋白进行验证,通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行亚细胞定位;最后采用实时荧光定量PCR检测该基因在SPF鸡不同组织/器官中的分布情况。结果表明:禽源PKR蛋白的分子式为C2744H4332N772O842S23,共编码550个氨基酸,理论分子质量为62346.63 u,等电点(pI)为8.63,不稳定系数为45.54,属于不稳定蛋白;二级结构中,α-螺旋占比为33.27%,延伸链占比为13.64%,β-转角占比为4.73%,无规则卷曲占比为48.36%;三级结构预测模型与人类PKR蛋白的相似性为47.29%。经双酶切验证成功构建了重组真核表达载体pEF1α-Myc-PKR,该载体可在DF1细胞中表达PKR蛋白,蛋白质分子量约为62 ku,具有良好的反应原性,且主要定位于细胞质中。禽源PKR基因在SPF鸡的17个受检组织/器官中均有表达,但在不同组织/器官中的表达量不同;在血液中的表达量最高,然后依次为胰腺、肠、肺脏、脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、腺胃、肌胃、皮肤、气管、脑和肾脏;在关节和肌肉中的表达量极低。说明PKR基因可能参与血液免疫反应,在先天免疫反应中扮演重要角色。 展开更多
关键词 禽源pkr基因 生物信息学 真核表达 亚细胞定位 组织表达特征
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草鱼免疫相关基因Prkrip1的克隆和表达分析 被引量:1
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作者 董锋 廖兰杰 +1 位作者 朱作言 汪亚平 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期728-734,共7页
随着草鱼养殖规模的扩大,草鱼的病毒性疾病极大地影响着草鱼的产量。开展鱼类病毒免疫反应相关功能基因的研究意义重大。研究首先通过同源克隆的方法从草鱼中克隆到了一段Prkrip1基因的EST序列,进一步通过RACE、长片段PCR和Genome walk... 随着草鱼养殖规模的扩大,草鱼的病毒性疾病极大地影响着草鱼的产量。开展鱼类病毒免疫反应相关功能基因的研究意义重大。研究首先通过同源克隆的方法从草鱼中克隆到了一段Prkrip1基因的EST序列,进一步通过RACE、长片段PCR和Genome walking的方法获得了该基因的全长cDNA序列、基因组DNA序列和启动子区序列。氨基酸序列分析显示,Prkrip1含有3个核定位信号和一个双链RNA结合区,并具有与PKR结合的保守N端区;荧光报告基因的表达证实我们所克隆到的启动子区是有活性的,可用于后续该基因的转录调控分析;Real-time PCR分析发现,Prkrip1基因在草鱼的肝和血中表达量最高,GCRV感染后在大部分免疫组织中均上调表达,说明该基因确实与病毒感染相关。研究结果为Prkrip1基因在硬骨鱼类的功能研究提供了线索,也为鱼类天然免疫反应中调控PKR信号通路的系统研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 Prkrip1 pkr 克隆 表达 病毒感染
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