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稳定表达猪Mx2蛋白的PK-15细胞系构建及鉴定
1
作者 王彩荷 梁玉斌 +7 位作者 孙普 赵志荀 王润泽 李平花 卢曾军 杜晓华 刘霞 马雪青 《微生物学通报》 北大核心 2025年第11期5215-5225,共11页
【背景】猪Mx2蛋白是Mx蛋白家族中的一员,属于干扰素诱导的GTP酶,在宿主抗病毒免疫反应中发挥关键作用。【目的】为探究猪Mx2蛋白的功能特性,通过慢病毒载体系统构建稳定表达猪Mx2蛋白的PK-15细胞系。【方法】根据GenBank数据库中猪Mx2... 【背景】猪Mx2蛋白是Mx蛋白家族中的一员,属于干扰素诱导的GTP酶,在宿主抗病毒免疫反应中发挥关键作用。【目的】为探究猪Mx2蛋白的功能特性,通过慢病毒载体系统构建稳定表达猪Mx2蛋白的PK-15细胞系。【方法】根据GenBank数据库中猪Mx2基因的核苷酸序列设计特异性引物,扩增出目的基因后构建重组慢病毒质粒,利用三质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒,将获得的重组慢病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达猪Mx2蛋白的PK-15细胞系,使用CCK-8法对细胞系的活力进行检测,利用Western blotting方法分析构建细胞系的猪Mx2蛋白表达水平,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting和半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50%, TCID50)评价细胞系对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)复制的影响。【结果】构建了稳定表达猪Mx2蛋白的PK-15细胞系。相较于野生型PK-15细胞,猪Mx2蛋白稳定表达细胞系中猪Mx2表达量显著上升,并且对PRV的复制具有抑制作用。【结论】PK-15细胞系的构建为深入探究猪Mx2蛋白的功能特性以及抗病毒作用机制提供了重要的工具。 展开更多
关键词 II型黏病毒抗性蛋白(Mx2) 慢病毒包装 pk-15细胞系 伪狂犬病病毒
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nup155基因敲除的PK-15细胞系
2
作者 孙瑜嘉 殷娟斌 +6 位作者 刘瀛 李可卿 曹轶梅 朵红 卢曾军 赵志荀 张强 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期569-576,共8页
本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株,并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sg RNA,与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装;再使用2μg/m L嘌呤霉素筛选细胞... 本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株,并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sg RNA,与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装;再使用2μg/m L嘌呤霉素筛选细胞株;通过RT-qPCR和Western-blot来确认细胞中Nup155基因是否被敲除;最终通过CCK8试验检测Nup155基因敲除对PK-15细胞活性的影响。RT-qPCR及Westernblot结果显示,细胞株Nup155基因的m RNA和蛋白表达水平显著降低;CCK8试验结果显示,部分敲除Nup155基因的PK-15细胞活力下降。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了1株Nup155基因部分敲除的PK-15细胞系,并发现部分敲除Nup155基因会显著影响PK-15细胞活力,为深入研究Nup155基因的功能机制提供了理想的细胞模型。 展开更多
关键词 pk-15细胞 基因敲除 Nup155 慢病毒包装
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谷胱甘肽对镉致猪肾PK-15细胞氧化损伤及凋亡的修复作用
3
作者 董志芳 张丽 朱向博 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2403-2412,共10页
本研究探索了谷胱甘肽(glutathione,GSH)对镉(cadmium,Cd)所引起的PK-15细胞损伤的修复功能及其背后的作用机制。本研究主要针对猪肾PK-15细胞,利用MTT检测、光学显微镜观察、透射电镜观察、JC-1染色、彗星试验和流式细胞术等多种研究方... 本研究探索了谷胱甘肽(glutathione,GSH)对镉(cadmium,Cd)所引起的PK-15细胞损伤的修复功能及其背后的作用机制。本研究主要针对猪肾PK-15细胞,利用MTT检测、光学显微镜观察、透射电镜观察、JC-1染色、彗星试验和流式细胞术等多种研究方法,检测GSH对Cd所造成的细胞氧化损伤及细胞凋亡的修复作用。结果显示,GSH显著缓解了Cd引起的PK-15细胞活性下降,维持ROS的稳态,从而缓解DNA和线粒体损伤及细胞凋亡等现象。Western blot结果表明,GSH可能通过上调抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达、下调促凋亡蛋白Bax的表达,进而对Cd诱导的PK-15细胞凋亡产生抑制作用。综上所述,GSH可以通过抑制氧化应激反应和减少细胞凋亡来缓解Cd诱导的PK-15细胞损伤。 展开更多
关键词 谷胱甘肽 镉 pk-15细胞 氧化损伤 细胞凋亡
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稳定表达UL54蛋白的PK-15细胞株对UL54基因缺失重组伪狂犬病病毒复制效率的影响
4
作者 李明智 吴红霞 +1 位作者 王异民 孙元 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第6期1117-1125,共9页
UL54蛋白是伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的非结构蛋白。电镜观察结果显示,多数UL54基因缺失的重组PRV(rPRV-ΔUL54)的病毒粒子仅有核衣壳,缺少完整的囊膜结构。病毒粒子结构的不完整导致病毒的感染效率显著降低,无法用于对UL5... UL54蛋白是伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的非结构蛋白。电镜观察结果显示,多数UL54基因缺失的重组PRV(rPRV-ΔUL54)的病毒粒子仅有核衣壳,缺少完整的囊膜结构。病毒粒子结构的不完整导致病毒的感染效率显著降低,无法用于对UL54的基因功能及作用机制的研究。本研究将UL54基因克隆至慢病毒载体pLVX-IRES-Puro,经慢病毒转导后,PK-15细胞表达UL54蛋白。通过PCR、间接免疫荧光试验及蛋白质免疫印迹法进行鉴定,成功构建了过表达UL54蛋白的细胞株(PK-15-UL54)。在PK-15-UL54细胞株中接种UL54基因缺失病毒(rPRV-ΔUL54-Re)后,检测其复制情况。电子显微镜观察显示,rPRV-ΔUL54-Re病毒具有完整的病毒粒子结构;荧光显微镜观察结果表明,rPRV-ΔUL54-Re病毒能够正常感染细胞并进行复制;定量PCR检测结果表明,rPRV-ΔUL54-Re病毒的复制效率有所提高。因此,PK-15-UL54细胞株是提高UL54基因缺失重组PRV复制效率的重要工具,可在探究UL54基因调控PRV复制机制的研究中发挥重要作用。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 慢病毒载体 UL54基因 pk-15细胞
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猪细小病毒感染PK-15细胞抗病毒相关因子转录变化的分析 被引量：11
5
作者 李厚伟 魏战勇 +4 位作者 尹海燕 陈红英 李金磊 韩志涛 崔保安 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期48-55,共8页
为了解猪细小病毒(PPV)感染后引起干扰素及其相关细胞因子的反应,探讨宿主—病毒之间的作用关系,作者运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-... 为了解猪细小病毒(PPV)感染后引起干扰素及其相关细胞因子的反应,探讨宿主—病毒之间的作用关系,作者运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF-3的转录水平。结果显示,PPV感染PK-15细胞12h病毒开始大量迅速增殖,48h达到最高峰;PPV感染后可引起PK-15细胞中IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、Mx1、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF-3的转录量显著增加,其中Mx1基因在24h转录量达到8 423倍。猪细小病毒感染可引起PK-15细胞抗病毒相关因子转录增加。 展开更多
关键词 猪细小病毒 细胞因子 pk-15细胞 转录时相
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可逆识别Cu^(2+)的吡唑啉荧光猝灭型探针及其在PK-15细胞成像中的应用 被引量：7
6
作者 张应鹏 尤彩霞 +3 位作者 杨云裳 刘小育 郭慧琛 董玉莹 《有机化学》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1401-1406,共6页
设计合成了1-(2-羟基苯基)-4-(9-蒽基)-3-苯并噻唑基吡唑啉(P1),通过紫外吸收和荧光光谱法研究了化合物与金属离子的识别特性,并研究了其在PK-15活细胞中进行荧光显微成像实验.研究结果表明荧光探针P1能快速、高选择、可逆地识别Cu^(2+)... 设计合成了1-(2-羟基苯基)-4-(9-蒽基)-3-苯并噻唑基吡唑啉(P1),通过紫外吸收和荧光光谱法研究了化合物与金属离子的识别特性,并研究了其在PK-15活细胞中进行荧光显微成像实验.研究结果表明荧光探针P1能快速、高选择、可逆地识别Cu^(2+),细胞毒性实验和荧光免疫分析实验证明,所制备的荧光探针具有很好的生物相容性和低毒性. 展开更多
关键词 吡唑啉 荧光探针 铜离子 识别 pk-15活细胞
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复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒的PK-15细胞中Bcl-2/BAXmRNA转录的影响 被引量：7
7
作者 邵秋红 凌榕镔 +3 位作者 朱兆荣 刘娟 郭志兴 王鹏 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期2242-2250,共9页
【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的猪肾细胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,... 【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的猪肾细胞(PK-15)中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组,在测定了病毒半数感染细胞量(TCID50),复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后,制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Bcl-2和BAX mRNA转录情况。【结果】与空白组相比,模型组的PK-15细胞发生了明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),细胞变细长,细胞间成网状,细胞核着色较浅,出现核浓缩、固缩、碎裂等现象;与模型组比,复方苦芩组与黄芪多糖组细胞病变得到改善,而复方苦芩组效果更加明显,大部分细胞核结构清晰,染色质着色均一,少部分细胞核变大或碎裂;与空白组相比,模型组Bcl-2 mRNA转录量减少(P<0.01),复方苦芩组Bcl-2基因转录量增加,为模型组的1.403倍(P<0.01)、黄芪多糖组的1.078倍(P>0.05);与空白组相比,模型组BAX mRNA转录量明显升高,而其他3组BAX基因转录差异不明显(P>0.05),模型组BAX基因转录量为空白组的1.440倍、复方苦芩组1.290倍、黄芪多糖组的1.490倍,差异极显著(P<0.01),复方苦芩组、黄芪多糖组BAX基因转录量分别为空白组的1.116倍、0.966倍,差异不显著(P>0.05);与空白组相比,模型组Bcl-2/BAX mRNA转录比值降低,差异极显著(P<0.01);与模型组相比,复方苦芩组、黄芪多糖组Bcl-2/BAX mRNA转录比值均增加,分别为模型组1.809倍和1.940倍,差异极显著(P<0.01),复方苦芩组Bcl-2/BAX mRNA转录比值分别为空白组的0.749倍(P<0.01)、黄芪多糖组的0.933倍(P>0.05)。【结论】复方苦芩可通过上调PK-15细胞Bcl-2 mRNA转录,下调BAX mRNA的转录,从而抑制TGEV引起的PK-15细胞凋亡。 展开更多
关键词 复方苦芩 猪传染性胃肠炎病毒 pk-15 Bcl-2 BAX 荧光定量PCR
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PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定 被引量：8
8
作者 李珣 陈思宇 +1 位作者 胡传活 王晓晔 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期726-730,共5页
【目的】构建PK-15细胞酵母双杂交三框eDNA文库，为深入研究猪伪狂犬病病毒（PRV）与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA，采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA（dscDNA），并对其进行均一化和SfiI酶切处... 【目的】构建PK-15细胞酵母双杂交三框eDNA文库，为深入研究猪伪狂犬病病毒（PRV）与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA，采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA（dscDNA），并对其进行均一化和SfiI酶切处理。，处理后的dscDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体，将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库，取三框cDNA初级文库进行混合扩增，通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率，最后收集文库细菌提取文库质粒。【结果】3种读码框cDNA文库的库容量分别为3．0×10^6,2．0×10^6和2．0×10^6CFU，文库实际扩增基数〉150万CFU；一号和三号读码框的基因重组率均为100％，二号读码框的基因重组率大于93％。cDNA文库外源基因插入片段长度在500～3000bp。cDNA文库质粒浓度约1．0mg/mL，质粒收获量约3．0mg。【结论】构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量，符合酵母双杂交筛选要求，可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制。 展开更多
关键词 pk-15细胞 酵母双杂交 三框cDNA文库 均一化 猪伪狂犬病病毒(PRV)
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PK-15细胞在微载体悬浮放大培养及PCV2增殖工艺研究 被引量：5
9
作者 华涛 冯磊 +7 位作者 张雪花 唐波 常晨 刘国阳 吴培培 陈丽 张道华 侯继波 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期474-480,共7页
为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L... 为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1 L反应器放大至3 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3 d细胞密度可达34.3×105cells/m L。采用感染复数为0.1的接毒比例,细胞接毒后在微载体上传至第3代收获毒液可获得最高的PCV2增殖效价107.25TCID50/m L。为PCV2疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 pk-15细胞 微载体 消化放大 猪圆环病毒2型 悬浮培养
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稳定表达猪Viperin的PK-15细胞系的构建与鉴定 被引量：5
10
作者 李文良 毛立 +3 位作者 杨蕾蕾 郝飞 张纹纹 江杰元 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第1期128-132,共5页
为了探讨先天免疫效应因子Viperin的抗病毒作用,从猪外周血单核细胞中成功扩增了猪Viperin基因完整阅读框,克隆到真核表达载体p EGFP-C1中构建重组表达质粒p EGFP-Vi。阳性质粒经PCR、酶切和测序鉴定后通过脂质体Lipofectamine 2000介... 为了探讨先天免疫效应因子Viperin的抗病毒作用,从猪外周血单核细胞中成功扩增了猪Viperin基因完整阅读框,克隆到真核表达载体p EGFP-C1中构建重组表达质粒p EGFP-Vi。阳性质粒经PCR、酶切和测序鉴定后通过脂质体Lipofectamine 2000介导转染PK-15细胞,荧光显微镜观察发现融合蛋白质EGFP-Viperin定位于细胞质中,不同于对照质粒EGFP在细胞中的均匀分布。共聚焦检测结果表明,重组蛋白质主要定位于细胞的内质网上。Western blot检测结果表明,猪Viperin蛋白质在PK-15细胞中以融合蛋白质的形式稳定表达,分子量约为7.0×104。 展开更多
关键词 猪 Viperin pk-15细胞系 表达
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携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达 被引量：3
11
作者 姚清侠 刘新文 +2 位作者 钱平 郭东春 陈焕春 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期141-144,共4页
将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上... 将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。 展开更多
关键词 猪Γ干扰素 逆转录病毒 PA317细胞 pk-15细胞 表达 抗病毒活性 水泡性口炎病毒 口蹄疫病毒
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载体介导的shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖特性的研究 被引量：5
12
作者 冶贵生 张彦明 徐浩 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期500-505,共6页
利用生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGe... 利用生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGene-NS3-Negative。重组干扰载体经纯化后转染PK-15细胞,并进行G418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒Shimen株,收集细胞分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明,与对照细胞比较,pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子均在一定程度上沉默了病毒的基因,抑制率约为63%、46%、49%。ELISA检测结果表明,转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 RNAI NS3基因 SHRNA pk-15细胞
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微载体培养PK-15细胞试验条件的优化 被引量：6
13
作者 何锡忠 李春华 +2 位作者 倪建平 蒋风英 邹勇 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第8期20-23,共4页
为了优化PK-15细胞在微载体上的生长条件,在微载体浓度5 mg/mL、低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液条件下,观察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的细胞接种密度对细胞生长的影响;在低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液、接种密度5×1... 为了优化PK-15细胞在微载体上的生长条件,在微载体浓度5 mg/mL、低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液条件下,观察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的细胞接种密度对细胞生长的影响;在低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液、接种密度5×104cells/mg条件下,观察3、5、10 mg/mL微载体浓度对细胞生长的影响;在3 mg/mL微载体浓度条件下、接种密度25×104cells/mL,观察MEM、高糖DMEM和低糖DMEM培养基对细胞生长的影响。结果表明,以微载体接种细胞密度4.5×104cells/mg、微载体浓度5 mg/mL在低糖DMEM培养基中培养方式效果最为理想。优化的培养工艺适用于PK-15细胞的生产。 展开更多
关键词 微载体培养 pk-15细胞 培养条件
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猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞产生IFN-β的信号通路研究 被引量：3
14
作者 张新晨 赵其岭 +4 位作者 陈萌萌 孙嘉瑞 鲍恩东 张书霞 吕英军 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期2008-2016,共9页
【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795... 【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795(TBK1/IKKε抑制剂)组、BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)组和BX795+BAY11-7082(混合抑制剂)组。BX795组、BAY 11-7082组、BX795+BAY 11-7082组分别用0.5μmol BX795、5μmol BAY11-7082、0.5μmol BX795+5μmol BAY 11-7082预先处理1 h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72 h收集细胞,提取RNA。用荧光定量PCR检测IFN-β、模式识别受体(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA 含量。【结果】PCV2感染PK-15细胞后,IFN-β的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P<0.01),表明PCV2感染可以诱导PK-15细胞生成IFN-β;TLR3的mRNA 含量在48 h显著升高(P<0.01),TLR9的表达量在48、72 h显著升高(P<0.01);TLR3和TLR9下游的接头蛋白MyD88和TRIF的mRNA 含量在48 h显著升高(P<0.01),表明PCV2激活了Toll样受体介导的NF-κB信号途径;MDA-5的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P<0.01),RIG-1的mRNA 含量在72 h显著升高(P<0.01),MDA-5和RIG-1下游的接头蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA 含量在48 h显著升高(P<0.01),表明PCV2激活了RIG-1样受体介导的IRF3信号途径;DAI的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P<0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式识别受体介导的IRF3信号途径;分别用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介导的信号通路,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比无显著性差异(P>0.05),TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比明显下降(P<0.05),表明PCV2诱导IFN-β的产生主要由IRF3信号途径调控。【结论】PCV2感染可以诱导PK-15细胞中IFN-β表达量的上调,其上调主要与IRF3信号通路有关。 展开更多
关键词 PCV2 pk-15细胞 IFN-Β 信号通路 接头蛋白
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猪圆环病毒2型在转管微载体培养PK-15细胞中增殖动态 被引量：3
15
作者 杨霞 高金良 +7 位作者 陈陆 赵军 常洪涛 王新卫 刘红英 姚惠霞 王川庆 王永强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期146-148,共3页
为提高猪圆环病毒2型（PCV2）的增殖规模及单位体积内的病毒滴度,本研究利用转管微型反应器,采用荧光定量PCR检测方法,对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。结果显示,转管（内置0.6 g纸片载体）中接种约2.98×10^... 为提高猪圆环病毒2型（PCV2）的增殖规模及单位体积内的病毒滴度,本研究利用转管微型反应器,采用荧光定量PCR检测方法,对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。结果显示,转管（内置0.6 g纸片载体）中接种约2.98×10^7个DF-1细胞,培养7 d细胞增至1.93×10^8～2.0×10^8个,并确定培养7 d时为最佳接毒时间;病毒的最佳接种剂量为120.8 MOI,最佳收毒时间为接毒后的100 h,可达5.53E＋06以上。细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系,在细胞生长期内（168 h）平均每个细胞耗糖量为3.09×10^-8g/24 h,可以根据糖耗量的多少推测细胞生长状态和数量。相同培养液中利用转管微型反应器培养PK-15细胞生产PCV2最终获得的病毒液毒价比转瓶培养毒价提高1.65倍。本实验为PCV2在生物反应器中大规模培养提供了参考依据。 展开更多
关键词 微载体 猪圆环病毒2型 pk-15细胞 转管微型反应器
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猪血凝性脑脊髓炎病毒在PK-15细胞中的增殖特性 被引量：3
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作者 潘伟 宋晗星 +4 位作者 赵传博 丁宁 陆慧君 贺文琦 高丰 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1409-1412,共4页
利用光学显微镜观察、间接免疫荧光(IFA)、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)等测定方法,分别从病毒抗原分布、病毒基因组复制水平以及病毒感染滴度变化等方面对猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV-67N)在猪肾上皮传代细胞系(PK-15细胞)上的... 利用光学显微镜观察、间接免疫荧光(IFA)、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)等测定方法,分别从病毒抗原分布、病毒基因组复制水平以及病毒感染滴度变化等方面对猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV-67N)在猪肾上皮传代细胞系(PK-15细胞)上的增殖特性进行了研究。使用HEV-67N株感染24孔细胞培养板内的PK-15细胞,接种剂量为400个TCID50(104.37)/孔,间接免疫荧光检测结果显示,在感染后8h即可检测到被荧光抗体标记的感染细胞,且随着感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,至感染后32h,几乎所有的细胞均出现有荧光。Real-time PCR检测结果显示,病毒基因组RNA的复制在感染后32～48h呈快速上升趋势,其基因组拷贝数在感染后48h达到最高值,之后增殖速度减慢,至感染后56h细胞出现CPE。TCID50的测定结果显示,HEV感染滴度的变化趋势与基因组RNA含量的变化相一致,在感染后32～48h增殖速度最快,之后逐渐减缓,至72h病毒感染滴度达到最高。 展开更多
关键词 猪血凝性脑脊髓炎病毒 pk-15细胞 增殖特性
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稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立 被引量：2
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作者 田宏 吴锦艳 +5 位作者 龚真莉 郑海学 孙世琪 尚佑军 刘湘涛 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期478-482,共5页
从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒... 从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。 展开更多
关键词 猪水疱病病毒P1基因 重组逆转录病毒载体 pk-15细胞 基因表达
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塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究 被引量：2
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作者 王晶 郭禹 +7 位作者 赵云环 顾文源 刘涛 翟刚 张帅 王丙雷 左玉柱 范京惠 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期431-438,共8页
本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。... 本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平(P<0.01);同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高(P<0.01)。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。 展开更多
关键词 塞内卡病毒A(SVA) 结构蛋白VP2 pk-15细胞 自噬
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PPV感染PK-15细胞后对4种抗病毒细胞因子mRNA转录时相的影响 被引量：2
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作者 耿静微 李厚伟 +5 位作者 尹海燕 陈红英 李金磊 韩志涛 崔保安 魏战勇 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第2期17-22,共6页
【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬... 【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PGK1 mRNA的相对表达量在感染后2 h显著增加,之后下降;TGF-β1 mRNA的相对表达量在72 h时显著增加;MURR1 mRNA的相对表达量在24 h时显著增加,48 h后下降。【结论】PPV感染可引起PK-15细胞抗病毒因子mRNA表达水平升高。 展开更多
关键词 猪细小病毒 细胞因子 pk-15细胞 转录时相
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PCV-2感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响 被引量：2
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作者 韩志涛 李金磊 +5 位作者 陈红英 王淑娟 耿静微 翟阿官 魏战勇 崔保安 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第6期15-19,24,共6页
【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子... 【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子IFN-βI、FN-γI、FNAR-1I、FNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、RNaseL和IRF-3 mRNA转录水平的变化。【结果】PCV-2感染PK-15后1 h就可以检测到病毒DNA,在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖,于感染72 h时达到最高峰。与0 h相比,PCV-2感染后IFN-βI、RF-3的表达量在感染12 h时显著增加,其他时间表达量下降;IFN-γ、MHC-Ⅱ的表达量在感染12 h时增加不明显,其他时间表达量下降;感染PCV-2后IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MX1的表达量下降;RNaseL的表达量在感染12 h时显著减少,其他时间表达量增加,48 h时表达量增加显著;IFNAR-1的表达量在感染72 h时显著增加,其他时间表达量下降;未检测出NOS的表达。【结论】随着PCV-2病毒含量的增加,以上几种主要抗病毒因子的表达量不明显或有所下降,表明PCV-2感染PK-15细胞后可逃避机体的抗病毒作用机制。 展开更多
关键词 细胞因子 pk-15细胞 猪圆环病毒2型 转录时相
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