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人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究 被引量：5
1
作者 马骊 王小宁 +3 位作者 张智清 周小明 曾革非 陈爱君 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期61-65,共5页
目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris... 目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中 ,构建重组质粒pPIC9K Flt 1(2 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。表达产物经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,测定其生物学活性。结果 :SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4d的表达量达上清总蛋白的 6 0 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,Flt 1(2 3)纯度达到 90 %以上。生物学活性检测证实其具有结合hVEGF1 6 5 的能力和抑制hVEGF1 6 5 对HUVEC的促增殖功能。结论 :获得了具有生物学活性的可溶性重组Flt 1受体胞外区 2 3loop小片段 ,为进一步的动物实验和临床应用打下了基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 FLT-1 基因表达 pichia.pasto
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肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达 被引量：2
2
作者 周世力 李琳琳 《江汉大学学报（自然科学版）》 2006年第3期41-43,52,共4页
利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法... 利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性. 展开更多
关键词 肠道病毒71型 VP3 巴斯德毕赤酵母 GS115菌株
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新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究 被引量：2
3
作者 付平平 黎洋 《中国免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2000年第7期378-380,共3页
目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确... 目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确的；经SDS-PAGE分析，证明转化基因组中确实整合有VGF基因，其分子量为9．6kD；得到了高效分泌型VGF高产菌株，目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80％以上，产量为0.45g/L。结论：证实可以通过Pichia.pasoris系统制备可溶性痘菌病毒生长因子。为大规模工业生产打下基础。 展开更多
关键词 痘苗病毒生长因子 酵母表达系统 分泌型表达
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维氏气单胞菌噬菌体裂解酶在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析
4
作者 张晓宇 王楠 +7 位作者 徐时长 夏锐 药园园 冉超 张震 丁倩雯 杨雅麟 周志刚 《中国农业科技导报(中英文)》 北大核心 2026年第2期145-152,共8页
维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是水产动物养殖中常见革兰氏阴性病原菌,由于其自身产生的细胞外膜具有一定的屏蔽作用,导致多种抗生素和抗菌制剂难以将其杀灭。经生物信息学分析,从噬菌体数据库中筛选到1条革兰氏阴性细菌噬菌体裂解... 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是水产动物养殖中常见革兰氏阴性病原菌,由于其自身产生的细胞外膜具有一定的屏蔽作用,导致多种抗生素和抗菌制剂难以将其杀灭。经生物信息学分析,从噬菌体数据库中筛选到1条革兰氏阴性细菌噬菌体裂解酶的氨基酸序列,具有该酶所特有的N端催化结构域和C端两亲性α-螺旋结构基序。为鉴定该氨基酸序列是否具有抑菌活性,将其编码基因按照酵母密码子优化并进行人工合成,转化至毕赤酵母GS115中进行组成型分泌表达,获得了重组维氏气单胞菌噬菌体裂解酶(LYS2),分泌表达量为140 mg·L^(-1)。LYS2对维氏气单胞菌Hm091具有显著的抑菌活性,体外最小抑菌浓度为3μg·mL^(-1);体外最适抑菌条件为42℃、pH 4~10;在4~50℃和pH 4~7条件下可保持活性稳定;对鱼类消化道常见金属离子和蛋白酶表现出良好的耐受性。研究结果为水产动物养殖过程中维氏气单胞菌的预防与治疗提供了一种新的具有应用潜力的抗菌蛋白,为该抗菌蛋白的生产和应用奠定了理论基础和技术支撑。 展开更多
关键词 维氏气单胞菌 噬菌体裂解酶 毕赤酵母 重组表达 抑菌活性
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重组犬干扰素-α3抗病毒活性分析及初步应用
5
作者 张东亮 刘方圆 +7 位作者 张海玲 张蕾 廉士珍 李双双 闫如勋 李伟 汪玉彬 徐凤宇 《病毒学报》 北大核心 2026年第1期242-252,共11页
目的干扰素具有广谱抗病毒活性,在临床上具有重要应用价值,开发犬长效干扰素是当前宠物抗病毒药物研究的重点。方法本研究将犬IFN-α3成熟肽基因通过密码子优化后,构建到pPICZαA酵母表达载体上,上、下游分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ限制性... 目的干扰素具有广谱抗病毒活性,在临床上具有重要应用价值,开发犬长效干扰素是当前宠物抗病毒药物研究的重点。方法本研究将犬IFN-α3成熟肽基因通过密码子优化后,构建到pPICZαA酵母表达载体上,上、下游分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点,阳性质粒经SacⅠ限制酶线性化后,电转化X33酵母菌感受态细胞,在含有100 mg/mL Zecoin抗性YPD培养基上挑取规则菌落,经AXO1鉴定引物PCR鉴定为阳性,阳性菌株经甲醇诱导表达,SDS-PAGE表明犬IFN-α3成功在酵母中分泌表达,表达产物大小为20~25 kDa,表达量0.95 mg/mL。应用微量细胞病变抑制法测定发酵原液及纯化rCaIFN-α3在MDCK上对VSV-GFP的抗病毒活性,发酵原液活性为8×1^(6)IU/mL,纯化产物活性为2×108 IU/mg。在F81上对CPV、RDPV、MEV复制均有抑制作用,抑制效果无显著差异(P>0.05)。结果根据标准曲线计算血清中rCaIFN-α3血药浓度,在注射后40 h达到药物浓度峰值,为458.733 pg/mL,随后浓度缓慢下降。注射rCaIFN-α剂量4×1^(5)IU/kg、4×1^(6)IU/kg、4×1^(7)IU/kg,对体温、白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数量没有影响,主要组织HE染色无明显病理变化。与辅助治疗组和RDPV对照组相比,4×1^(5)IU/kg剂量注射rCaIFN-α3预防用药联合辅助治疗组和rCaIFN-α3联合辅助治疗组显著降低不同时间貉粪便中病毒载量,其中预防用药组效果最好,有效率80%,死亡率20%。结论综上所述,本研究建立了高效表达r CaIFN-α3的毕赤酵母表达系统,表达产物具有显著的抗病毒活性和良好的安全性,为开发长效重组犬IFN-α抗病毒制剂奠定了基础。 展开更多
关键词 犬干扰素-α3 酵母表达 抗病毒活性分析 血清药物浓度 安全性实验
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利用甲醇合成透明质酸及其寡糖的毕赤酵母细胞工厂的构建与优化
6
作者 叶子扬 朱泰承 +1 位作者 李寅 毛相朝 《食品工业科技》 北大核心 2026年第5期217-226,共10页
透明质酸是一种广泛用于食品、医药和化妆品领域的高价值糖胺聚糖。为探索更绿色、经济的透明质酸生产方式,本研究以毕赤酵母为细胞工厂,评估了利用一碳甲醇合成透明质酸的可行性。首先,在毕赤酵母中设计并构建了透明质酸合成途径,通过... 透明质酸是一种广泛用于食品、医药和化妆品领域的高价值糖胺聚糖。为探索更绿色、经济的透明质酸生产方式,本研究以毕赤酵母为细胞工厂,评估了利用一碳甲醇合成透明质酸的可行性。首先,在毕赤酵母中设计并构建了透明质酸合成途径,通过液相色谱和质谱分析对产物进行了定量和定性检测,验证了细胞工厂的成功构建。在此基础上,筛选了不同来源的透明质酸合酶以提升产量。结果显示,来源于兽疫链球菌的透明质酸合酶seHAS具有最高的合成效率,在摇瓶发酵条件下透明质酸产量达到941 mg/L,分子量约1100 kDa。此外,本研究还筛选了高活性表达的透明质酸降解酶,并通过外源添加或共表达的方式,探究了透明质酸生产效率的限制因素。结果表明,降解酶FhChAC能够在毕赤酵母中高效表达。通过外源添加或共表达FhChAC能有效释放积累在细胞表面的透明质酸多糖,并将其降解为寡糖,从而显著提升生产效率。通过以上优化,最终在摇瓶发酵中获得了5.6 g/L不饱和二糖形式的透明质酸寡糖产物。本研究为工程毕赤酵母利用一碳甲醇生产透明质酸提供了重要的理论和技术参考。 展开更多
关键词 透明质酸 毕赤酵母 代谢工程 透明质酸降解酶 透明质酸合酶 甲醇
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响应面法优化一株克鲁维毕赤酵母的培养条件
7
作者 熊灵 林颖 +4 位作者 丁波 吴正云 赵书田 吴浪 张文学 《中国调味品》 北大核心 2026年第2期53-59,共7页
为提高活性菌体含量以制备活性干酵母,以OD_(600 nm)为响应值,该研究通过单因素试验和响应面试验优化一株克鲁维毕赤酵母(M2)培养基及培养条件。结果表明,该菌株生长最适基础培养基为YPD液体培养基,最佳培养条件为以68 g/L葡萄糖作为碳... 为提高活性菌体含量以制备活性干酵母,以OD_(600 nm)为响应值,该研究通过单因素试验和响应面试验优化一株克鲁维毕赤酵母(M2)培养基及培养条件。结果表明,该菌株生长最适基础培养基为YPD液体培养基,最佳培养条件为以68 g/L葡萄糖作为碳源,24 g/L蛋白胨、15 g/L酵母浸粉、2 g/L硫酸铵作为氮源,装液量为20%,培养温度为28℃,摇床转速为180 r/min,初始pH为5.6。优化后,培养20 h时M2菌株生物量比优化前提高了37.16%。通过喷雾干燥制备的活性干酵母活菌率为87.1%,在4℃下贮存稳定性比常温下好,且4个月后活菌率仍高于70%。 展开更多
关键词 克鲁维毕赤酵母 培养条件优化 响应面法 贮存稳定性
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分子伴侣对毕赤酵母表达单域抗体的影响
8
作者 苏伟明 秦也 +2 位作者 张海伟 孙宾莲 龚睿 《生物工程学报》 北大核心 2026年第2期840-851,共12页
单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs)因其低分子量和优异的组织穿透性,在生物医药领域的应用日益广泛。相较于哺乳动物细胞和大肠杆菌表达体系,毕赤酵母表达系统兼具成本低、周期短的特性以及完善的蛋白折叠支持能力。为了提升酵... 单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs)因其低分子量和优异的组织穿透性,在生物医药领域的应用日益广泛。相较于哺乳动物细胞和大肠杆菌表达体系,毕赤酵母表达系统兼具成本低、周期短的特性以及完善的蛋白折叠支持能力。为了提升酵母表达sdAbs的效率,本研究构建了6种分子伴侣(HDPI、YPDI、BZIP、TO、RPPO、Sec)与sdAb的酵母共表达体系。通过圆二色谱解析蛋白二级结构、测定热变性温度(thermal melting temperature,Tm)和蛋白半数变性尿素浓度(concentrations of urea when 50%protein unfolded,CUU),结合浊度实验和胰蛋白酶消化实验,系统评估了分子伴侣对抗体结构与功能特性的调控作用。结果显示:共表达Sec将sdAb表达水平显著提升了1.68倍;分子伴侣的引入均未改变sdAb的二级结构及抗原结合活性;热稳定性实验中,仅BZIP共表达组观察到热稳定性增强(T_(m)值提升2.4℃);尿素诱导变性实验中,YPDI共表达组的抗尿素变性能力显著提升(CUU值提高1.2 mol/L);胰蛋白酶消化实验显示,YPDI组的酶解稳定性最优(3 h后活性保留58.3%);浊度实验表明,YPDI与BZIP共表达可有效抑制抗体聚集,而HPDI、TO和RPPO则促进了聚集现象。综上所述,本研究揭示了不同分子伴侣对单域抗体理化性质的调控效应具有较显著差异。这些发现为优化单域抗体的生产工艺提供了重要的理论依据和实践参考。 展开更多
关键词 单域抗体 毕赤酵母 分子伴侣 二级结构 理化性质
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毕赤酵母降酸发酵对沙棘汁品质及风味的影响
9
作者 王道科 吴正鹏 +1 位作者 王墨阳 王金玲 《食品与发酵工业》 北大核心 2026年第4期234-241,I0012-I0015,共12页
为了研究毕赤酵母WJL-M4(Pichia terricola WJL-M4)接种于沙棘汁中进行降酸发酵对其品质及风味的影响,采用HPLC、感官评价、电子鼻和顶空固相萃取与气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME-GC-MS)技术,分析发... 为了研究毕赤酵母WJL-M4(Pichia terricola WJL-M4)接种于沙棘汁中进行降酸发酵对其品质及风味的影响,采用HPLC、感官评价、电子鼻和顶空固相萃取与气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME-GC-MS)技术,分析发酵前后沙棘汁有机酸、感官评分和风味的变化,并结合气味活度值(odor activity values,OAV)筛选关键香气物质。结果表明,降酸发酵后沙棘汁中苹果酸降解率达(85.37±0.67)%,感官评分显著提升,酸味明显减轻。电子鼻检测表明发酵沙棘汁香气更为浓郁。降酸发酵前后沙棘汁共检测出109种挥发性化合物,以酯类和醇类化合物为主。通过OAV共筛选出19种关键香气物质(OAV>1),正己酸乙酯和苯甲醇为降酸发酵沙棘汁赋予沙棘汁更多花香和果香。此外,降酸发酵后未检测到异戊酸、正戊酸和苯甲醛,有效去除沙棘汁的酸臭味和苦杏仁味。毕赤酵母WJL-M4降酸发酵能够显著提升沙棘汁感官及风味品质,为沙棘深加工提供理论依据和技术支撑。 展开更多
关键词 毕赤酵母 沙棘 降酸发酵 有机酸 挥发性化合物
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游离型与整合型共表达增强毕赤酵母表达抗菌肽的水平研究
10
作者 李嘉盛 陈颖禧 +2 位作者 徐梦珂 张宏刚 蒙海林 《食品安全质量检测学报》 2026年第1期137-145,共9页
目的建立游离型与整合型载体共表达系统,提高抗菌肽在毕赤酵母中的表达效率,解决其因拷贝数限制和表达不稳定性导致的产量不足问题。方法利用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来源的panARS自主复制序列,构建卡那霉素抗性的游离型... 目的建立游离型与整合型载体共表达系统,提高抗菌肽在毕赤酵母中的表达效率,解决其因拷贝数限制和表达不稳定性导致的产量不足问题。方法利用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来源的panARS自主复制序列,构建卡那霉素抗性的游离型表达载体pPICKαA-panARS-JS21T和pGAPKαA-panARS-JS21T,与整合型载体pPICZαA-JS21T共同电转化毕赤酵母X-33菌株。通过博来霉素Zeocin和遗传霉素G418双抗生素平板筛选阳性转化子,摇瓶发酵120 h以上,每24 h补加甲醇诱导表达。采用Bradford法测定分泌总蛋白含量,三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(trimethylglycine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE)检测目标条带,琼脂扩散法测定对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果发酵120 h后,整合型与游离型pGAPKαA-panARS-JS21T共表达组的上清总蛋白含量达到107.22μg/mL,比单一整合型表达组70.56μg/mL提高了52%;抑菌圈分析显示其抑菌活性提升129%(P<0.05)。整合型与pPICKαA-panARS-JS21T共表达组也比单一整合型组提升了15.8%。结论游离型与整合型载体共表达策略可协同提高抗菌肽JS21T在毕赤酵母中的表达水平,其效果优于单一载体系统,为小分子肽类高效生产提供了新思路。 展开更多
关键词 毕赤酵母 抗菌肽 游离型表达 整合型表达 共表达
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毕赤酵母水解物对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的吸附机理研究 被引量：1
11
作者 丁寅寅 孙晓璐 +3 位作者 廖洪梅 罗晓宏 张浩 尹鹏 《中国酿造》 北大核心 2025年第8期154-160,共7页
为了对毒素进行有效预防和脱除,以毕赤酵母(Pichia pastoris)为研究对象,通过毕赤酵母水解物(YHs)控制自溶时间、酶解时间并辅以机械破壁处理,制备了不同水解程度的酵母水解物(YH1~YH5)。以未水解的干酵母粉(YH0)为对照,探讨了不同水解... 为了对毒素进行有效预防和脱除,以毕赤酵母(Pichia pastoris)为研究对象,通过毕赤酵母水解物(YHs)控制自溶时间、酶解时间并辅以机械破壁处理,制备了不同水解程度的酵母水解物(YH1~YH5)。以未水解的干酵母粉(YH0)为对照,探讨了不同水解程度、不同添加量和不同pH条件下,YHs对玉米赤霉烯酮(ZEN)和呕吐毒素(DON)吸附效果的影响,并分析了吸附毒素前后的红外光谱图变化。此外,通过体外静态模拟消化实验,研究了YHs对ZEN和DON的吸附作用。结果表明,YH1~YH5对ZEN、DON的吸附、脱除效果均显著优于YH0(P<0.05),当YH5添加量为20 mg/mL,pH分别为4.5、9.5时对ZEN、DON的最大脱除率为85.48%、92.95%。通过红外光谱分析可知,ZEN主要通过疏水作用与YHs细胞壁外侧的甘露聚糖结合,DON则主要通过氢键与YHs结合。体外静态模拟消化实验结果表明,YHs能够在体内有效吸附DON,但对ZEN的吸附效果有限,无法实现有效脱除。 展开更多
关键词 毕赤酵母水解物 玉米赤霉烯酮 呕吐毒素 吸附 红外光谱 体外模拟消化
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不同乳酸菌抑制酸菜腐败菌——库德里阿兹威毕赤酵母的研究 被引量：2
12
作者 陀小莉 马晔 +2 位作者 代志鹏 赵凯 范洪臣 《中国调味品》 北大核心 2025年第3期90-97,共8页
库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一种常见的东北酸菜腐败菌,导致东北酸菜成膜、变软和产生异味等质量缺陷。从自然发酵的东北酸菜中分离出7株乳酸菌,对Pichia kudriavzevii HSDF-pks-2022(pks)进行抑制和发酵影响的研究。... 库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一种常见的东北酸菜腐败菌,导致东北酸菜成膜、变软和产生异味等质量缺陷。从自然发酵的东北酸菜中分离出7株乳酸菌,对Pichia kudriavzevii HSDF-pks-2022(pks)进行抑制和发酵影响的研究。通过对比pks的抑菌圈大小,从7株乳酸菌中筛选出5株抑制腐败菌pks明显的乳酸菌,分别为Levilactobacillus brevis HSDF-lbn-2022(lbn)、Lactobacillus sakei HSDF-lso-2022(qj)、Leuconostoc mesenteroides HSDF-lmo-2022(cm)、Loigolactobacillus coryniformis HSDF-lco-2022(rs)、Lactiplantibacillus xiangfangensis HSDF-lxo-2022(xf);通过乳酸菌和腐败菌在酸菜中共发酵,根据发酵液产pH、有机酸、腐败菌活菌数、生物膜形成量和生物胺情况,从5株乳酸菌中筛选出qj,其抑制pks的效果最好、pH最低(3.34)、有机酸含量最高(62.10 mg/mL)、腐败菌活菌数最少(5.00×10^(6)CFU/mL)、腐败菌生物膜形成量最少(0.021 g)、生物胺种类和含量也较少。不同的乳酸菌抑制pks的能力不同,qj有显著的抑制效果,该研究为发酵食品生物法抑制东北酸菜腐败提供了借鉴。 展开更多
关键词 清酒乳杆菌 腐败菌 库德里阿兹威毕赤酵母 酸菜
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抗菌肽在毕赤酵母中表达的研究进展 被引量：1
13
作者 查曼 闵勇 +5 位作者 刘晓艳 朱镭 邱一敏 陈凌 周荣华 王常高 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第13期354-361,共8页
抗菌肽是一类由原核生物和真核生物产生的小分子多肽,具有广谱抑菌活性,且不易引发微生物耐药性,因此被认为具有替代抗生素成为新一代抗菌药物的潜力。该文主要综述了抗菌肽的研究进展,并展望了其在医药、畜牧业、农业及食品领域中的应... 抗菌肽是一类由原核生物和真核生物产生的小分子多肽,具有广谱抑菌活性,且不易引发微生物耐药性,因此被认为具有替代抗生素成为新一代抗菌药物的潜力。该文主要综述了抗菌肽的研究进展,并展望了其在医药、畜牧业、农业及食品领域中的应用前景。此外,该文还总结了近年来抗菌肽在毕赤酵母中的重组表达研究,并探讨了提高抗菌肽在该系统中高效表达的优化策略,包括启动子、信号肽、蛋白伴侣的选择、基因剂量及发酵参数的优化。希望通过这些总结,为抗菌肽的应用开发和大规模生产提供有价值的参考。 展开更多
关键词 抗菌肽 抗生素 微生物耐药性 毕赤酵母 重组表达
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毕赤酵母利用甲醇生产重组蛋白技术的研究进展 被引量：1
14
作者 王媛媛 张翀 +1 位作者 韩双艳 邢新会 《化工进展》 北大核心 2025年第5期2441-2450,共10页
甲醇等一碳化合物作为生物制造的一种绿色可持续低碳原料,不存在与人争粮的问题,具有巨大的应用发展潜力。能够天然利用甲醇的毕赤酵母研究历史长,已被广泛应用于多种重组蛋白的生物制造中,成为甲醇利用性能优良的底盘细胞工厂。近年虽... 甲醇等一碳化合物作为生物制造的一种绿色可持续低碳原料,不存在与人争粮的问题,具有巨大的应用发展潜力。能够天然利用甲醇的毕赤酵母研究历史长,已被广泛应用于多种重组蛋白的生物制造中,成为甲醇利用性能优良的底盘细胞工厂。近年虽然对毕赤酵母的生理学、甲醇代谢网络、蛋白分泌表达途径及关键元件挖掘开展了大量的研究,积累了大量知识,但仍存在影响其高效应用的一系列关键问题,如甲醇及其代谢物对细胞毒性的复杂影响机制认知有限、细胞鲁棒性及甲醇利用相关的“生命暗物质”挖掘能力不足、甲醇高效转化成目标蛋白的工程化手段有限等。本文综述了国内外有关毕赤酵母生物转化甲醇合成重组蛋白的研究现状,重点总结讨论了毕赤酵母细胞工厂转化甲醇及蛋白表达优化策略,最后探讨了当前毕赤酵母生物转化甲醇生产重组蛋白过程中面临的挑战,并对其未来的生物技术创新和应用进行了展望。 展开更多
关键词 甲醇 毕赤酵母 重组蛋白 代谢工程 合成生物学
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谷氨酸废液生物转化浆液发酵条件优化及促生作用
15
作者 张迎 王志刚 +2 位作者 徐伟慧 胡云龙 陈文晶 《微生物学杂志》 北大核心 2025年第2期32-42,共11页
为探寻谷氨酸废液生物转化浆液资源化利用的方向,利用酵母菌对浆液进行发酵处理。利用添加浆液的培养基筛选出一株生物量较高的酵母菌株;通过单因素试验和响应面优化试验确定了酵母菌在浆液培养基中的主要影响因素及最优发酵条件;通过... 为探寻谷氨酸废液生物转化浆液资源化利用的方向,利用酵母菌对浆液进行发酵处理。利用添加浆液的培养基筛选出一株生物量较高的酵母菌株;通过单因素试验和响应面优化试验确定了酵母菌在浆液培养基中的主要影响因素及最优发酵条件;通过浸种试验评价了发酵液对水稻、小麦、玉米的促生效果。结果表明,库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) X-1作为发酵菌株生物量最大;菌株X-1发酵的碳源种类为葡萄糖,发酵的主要影响因素为葡萄糖浓度、摇瓶装液量和培养时间;菌株X-1在浆液培养基中最优发酵条件为90 g/L的葡萄糖浓度,187 mL/250 mL的摇瓶装液量,培养时间98 h。发酵液浸种提高水稻、玉米和小麦种子的发芽率,促进根的生长。综上所述,使用浆液作为发酵底物,既可以生产酵母菌,还能促进禾本科作物的生长。相关研究的开展,为后期谷氨酸废液生物转化浆液的利用提供参考与技术支持。 展开更多
关键词 谷氨酸废液生物转化浆液 库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) 发酵条件优化 促生 种子萌发
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降解桔霉素酵母菌的筛选及降解机理初探 被引量：2
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作者 王娅楠 陈定一 +3 位作者 匡林莎 李鑫 申家荣 王丽玲 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第6期112-119,共8页
桔霉素(citrinin,CIT)是具有肝脏毒性、肾脏毒性和细胞毒性的一种真菌毒素。为筛选出降解CIT的酵母菌,该文以新疆托木尔峰酒业酒醅及土壤、阿瓦提红葡萄为原料,经形态学鉴定共得到18株酵母菌。经初筛与复筛确定酵母菌PT降解CIT的效果最... 桔霉素(citrinin,CIT)是具有肝脏毒性、肾脏毒性和细胞毒性的一种真菌毒素。为筛选出降解CIT的酵母菌,该文以新疆托木尔峰酒业酒醅及土壤、阿瓦提红葡萄为原料,经形态学鉴定共得到18株酵母菌。经初筛与复筛确定酵母菌PT降解CIT的效果最好,通过分子生物学鉴定酵母菌PT为毕赤酵母菌属(Pichia属)。进一步研究了酵母菌PT的细胞壁、胞内代谢物和胞外代谢物对CIT降解效果的影响。结果表明,酵母菌PT的细胞壁、胞内代谢产物及胞外代谢产物均对CIT有一定的降解效果,降解率分别为21.2%、20.0%、18.8%,综合分析酵母菌PT对CIT既有细胞壁的吸附作用,也有胞内代谢物、胞外代谢物的协同作用,属于多组分协同降解。另外,酵母菌PT结合其他酵母菌对CIT的降解率基本不变,推测对CIT没有产生协同降解作用;为提高酵母菌PT对CIT的降解效果,研究了酵母菌PT结合物理吸附剂蒙脱土K-10对CIT降解效果的影响。结果表明,酵母菌培养120 h时对CIT降解效果达到73.4%。该研究筛选的酵母菌PT扩大了CIT降解菌的菌种库,为CIT的生物降解提供了一定的参考价值。 展开更多
关键词 桔霉素 毕赤酵母菌 降解组分 联合方法 鉴定
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豆豉纤溶酶基因的异源表达及其重组菌在淡豆豉中的应用 被引量：1
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作者 徐菁雯 乌日娜 +8 位作者 王伟明 阎亦然 向雪琴 赵玉莲 武俊瑞 王亚琦 邓丽 童星 史海粟 《食品科学》 北大核心 2025年第4期68-80,共13页
从不同来源及不同发酵阶段的淡豆豉中分离筛选出65株优势菌,通过酶联免疫吸附法测定纤溶酶活性,得到一株高产纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)20-1,并扩增其纤溶酶基因,在毕赤酵母中异源表达,获得高产纤溶酶的重组菌株Pichi... 从不同来源及不同发酵阶段的淡豆豉中分离筛选出65株优势菌,通过酶联免疫吸附法测定纤溶酶活性,得到一株高产纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)20-1,并扩增其纤溶酶基因,在毕赤酵母中异源表达,获得高产纤溶酶的重组菌株Pichia pastoris pPIC9K-his-aprEBS2,重组菌中该基因表达水平是出发菌株的5.8倍,培养48 h后纤溶酶活性达到(3 025.59±201.27)U/mL,是出发菌株的8.9倍;经优化,其活性可达(8 698.24±180.73)U/mL。通过急性毒性实验证明,该重组菌无毒。利用该重组菌纯种发酵淡豆豉,淡豆豉中纤溶酶活性达到(17 287.02±103.20)U/g,通过理化指标监测、感官特性分析及电子舌分析,重组菌可以提高淡豆豉的感官及风味。重组菌发酵的淡豆豉成品血栓溶解率可达到(60.55±1.58)%,高于市售淡豆豉。 展开更多
关键词 豆豉纤溶酶 异源表达 毕赤酵母 淡豆豉
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补饲瘤胃源活毕赤酵母菌液对奶水牛瘤胃发酵和营养物质降解率的影响 被引量：1
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作者 肖芬 毛家真 +3 位作者 向小娥 杨承剑 毛胜勇 金巍 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第8期22-27,共6页
旨在研究补饲瘤胃源活毕赤酵母(Pichia kudriavzevii,YPK)菌液对奶水牛瘤胃发酵和饲料营养物质降解特性的影响。选取6头体重相近、健康状况良好且装有永久性瘤胃瘘管的摩拉奶水牛为试验动物,随机分为2组,每组3头,分别为对照组(饲喂基础... 旨在研究补饲瘤胃源活毕赤酵母(Pichia kudriavzevii,YPK)菌液对奶水牛瘤胃发酵和饲料营养物质降解特性的影响。选取6头体重相近、健康状况良好且装有永久性瘤胃瘘管的摩拉奶水牛为试验动物,随机分为2组,每组3头,分别为对照组(饲喂基础日粮)和处理组(饲喂基础日粮+每头4×10^(11) CFU/d YPK菌液);测定奶水牛瘤胃发酵参数,采用尼龙袋法评定奶水牛瘤胃内不同发酵时间(2、4、8、12、24、48、72 h)饲料的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的降解特性。结果:与对照组相比,饲喂YPK极显著提高了瘤胃内乙酸(P<0.001)、丙酸(P=0.002)和总挥发性脂肪酸(P<0.001)浓度;饲喂YPK显著提高了DM(P<0.001)、CP(P=0.044)、NDF(P<0.001)、ADF(P<0.001)的瘤胃有效降解率。结论:日粮中添加YPK显著提高了奶水牛瘤胃乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度,提高了饲料营养物质瘤胃降解率,YPK具有开发成反刍动物功能益生菌的潜力。 展开更多
关键词 尼龙袋法 毕赤酵母 奶水牛 饲料营养物质 降解特性 瘤胃发酵参数
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合成GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 杂合型糖基结构糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建 被引量：1
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作者 王昊 王甜甜 +5 位作者 张斌 吴军 徐惠芳 张燕茹 刘克海 刘波 《生物工程学报》 北大核心 2025年第9期3617-3629,共13页
糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,参与调控蛋白质半衰期、生物活性和免疫原性等,进而影响其功能。毕赤酵母表达的糖蛋白的糖基外链主要由甘露糖组成,为高甘露糖型糖基,这与哺乳动物细胞表达糖蛋白时形成的复杂型糖基不同。本研究... 糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,参与调控蛋白质半衰期、生物活性和免疫原性等,进而影响其功能。毕赤酵母表达的糖蛋白的糖基外链主要由甘露糖组成,为高甘露糖型糖基,这与哺乳动物细胞表达糖蛋白时形成的复杂型糖基不同。本研究旨在通过基因工程手段,将毕赤酵母的高甘露糖的糖基化修饰形式改造为类似于哺乳动物细胞的杂合型糖基修饰形式。基于实验室前期获得的能够形成Man8GlcNAc_(2) 糖基的?och1毕赤酵母菌,本研究进一步引入了绿色木霉来源的甘露糖苷酶Ⅰ基因MDSⅠ、人源的β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ基因GnTⅠ。同时利用强诱导型AOX启动子和组成型GAP启动子,设计不同启动子组合来调控MDSⅠ、GnTⅠ基因表达。选择中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的刺突蛋白受体结合域(receptor-binding domain,RBD)377-588作为报告蛋白(MERS-RBD),利用PNGase F酶切、质谱等方法分析报告蛋白N-糖谱。在och1基因敲除菌基础上,引入不同启动子组合的MDSⅠ、GnTⅠ基因后,均成功得到GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 糖基化修饰形式的毕赤酵母工程菌株。当利用AOX启动子控制MDSⅠ基因和GAP启动子控制GnTⅠ基因时,工程菌的N糖基化修饰以杂合型GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 糖基占比最高,为68.38%。本研究成功得到了能够合成GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 杂合型糖基的毕赤酵母工程菌株,为后续毕赤酵母合成复杂型糖蛋白的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 毕赤酵母 糖基化 杂合型 中东呼吸综合征冠状病毒受体结合域
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毕赤酵母表达CD63单链抗体及其生物活性的鉴定 被引量：1
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作者 陈雪丹 蔡志坚 《生物工程学报》 北大核心 2025年第4期1440-1454,共15页
为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体,本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv),纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的... 为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体,本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv),纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的CD63单克隆抗体细胞株进行可变区测序得到重链可变区(variable heavy chain,VH)与轻链可变区(variable light chain,VL),经柔性肽连接构成scFv,通过密码子优化后全基因合成CD63 scFv序列并克隆至毕赤酵母表达质粒pPICZα-A,质粒经SacI线性化后电转到毕赤酵母X33,1%甲醇诱导表达sc Fv,发酵上清通过Ni柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting进行了鉴定。通过免疫印迹、免疫荧光、基于细胞的酶联免疫吸附实验、流式细胞术对CD63 scFv的生物活性进行鉴定。本研究成功构建了能够分泌表达抗CD63 scFv的毕赤酵母菌株,抗体分子量约为30 kDa,能与CD63蛋白特异性结合。抗CD63 scFv在毕赤酵母中的表达是一种经济有效的抗体获取方法,为大规模生产抗CD63抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 CD63单链抗体 毕赤酵母 分泌表达 亲和力 特异性
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