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人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究 被引量：5
1
作者 马骊 王小宁 +3 位作者 张智清 周小明 曾革非 陈爱君 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期61-65,共5页
目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris... 目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中 ,构建重组质粒pPIC9K Flt 1(2 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。表达产物经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,测定其生物学活性。结果 :SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4d的表达量达上清总蛋白的 6 0 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,Flt 1(2 3)纯度达到 90 %以上。生物学活性检测证实其具有结合hVEGF1 6 5 的能力和抑制hVEGF1 6 5 对HUVEC的促增殖功能。结论 :获得了具有生物学活性的可溶性重组Flt 1受体胞外区 2 3loop小片段 ,为进一步的动物实验和临床应用打下了基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 FLT-1 基因表达 pichia.pasto
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肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达 被引量：2
2
作者 周世力 李琳琳 《江汉大学学报（自然科学版）》 2006年第3期41-43,52,共4页
利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法... 利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性. 展开更多
关键词 肠道病毒71型 VP3 巴斯德毕赤酵母 GS115菌株
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新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究 被引量：2
3
作者 付平平 黎洋 《中国免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2000年第7期378-380,共3页
目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确... 目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确的；经SDS-PAGE分析，证明转化基因组中确实整合有VGF基因，其分子量为9．6kD；得到了高效分泌型VGF高产菌株，目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80％以上，产量为0.45g/L。结论：证实可以通过Pichia.pasoris系统制备可溶性痘菌病毒生长因子。为大规模工业生产打下基础。 展开更多
关键词 痘苗病毒生长因子 酵母表达系统 分泌型表达
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毕赤酵母水解物对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的吸附机理研究
4
作者 丁寅寅 孙晓璐 +3 位作者 廖洪梅 罗晓宏 张浩 尹鹏 《中国酿造》 北大核心 2025年第8期154-160,共7页
为了对毒素进行有效预防和脱除,以毕赤酵母(Pichia pastoris)为研究对象,通过毕赤酵母水解物(YHs)控制自溶时间、酶解时间并辅以机械破壁处理,制备了不同水解程度的酵母水解物(YH1~YH5)。以未水解的干酵母粉(YH0)为对照,探讨了不同水解... 为了对毒素进行有效预防和脱除,以毕赤酵母(Pichia pastoris)为研究对象,通过毕赤酵母水解物(YHs)控制自溶时间、酶解时间并辅以机械破壁处理,制备了不同水解程度的酵母水解物(YH1~YH5)。以未水解的干酵母粉(YH0)为对照,探讨了不同水解程度、不同添加量和不同pH条件下,YHs对玉米赤霉烯酮(ZEN)和呕吐毒素(DON)吸附效果的影响,并分析了吸附毒素前后的红外光谱图变化。此外,通过体外静态模拟消化实验,研究了YHs对ZEN和DON的吸附作用。结果表明,YH1~YH5对ZEN、DON的吸附、脱除效果均显著优于YH0(P<0.05),当YH5添加量为20 mg/mL,pH分别为4.5、9.5时对ZEN、DON的最大脱除率为85.48%、92.95%。通过红外光谱分析可知,ZEN主要通过疏水作用与YHs细胞壁外侧的甘露聚糖结合,DON则主要通过氢键与YHs结合。体外静态模拟消化实验结果表明,YHs能够在体内有效吸附DON,但对ZEN的吸附效果有限,无法实现有效脱除。 展开更多
关键词 毕赤酵母水解物 玉米赤霉烯酮 呕吐毒素 吸附 红外光谱 体外模拟消化
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不同乳酸菌抑制酸菜腐败菌——库德里阿兹威毕赤酵母的研究 被引量：2
5
作者 陀小莉 马晔 +2 位作者 代志鹏 赵凯 范洪臣 《中国调味品》 北大核心 2025年第3期90-97,共8页
库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一种常见的东北酸菜腐败菌,导致东北酸菜成膜、变软和产生异味等质量缺陷。从自然发酵的东北酸菜中分离出7株乳酸菌,对Pichia kudriavzevii HSDF-pks-2022(pks)进行抑制和发酵影响的研究。... 库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一种常见的东北酸菜腐败菌,导致东北酸菜成膜、变软和产生异味等质量缺陷。从自然发酵的东北酸菜中分离出7株乳酸菌,对Pichia kudriavzevii HSDF-pks-2022(pks)进行抑制和发酵影响的研究。通过对比pks的抑菌圈大小,从7株乳酸菌中筛选出5株抑制腐败菌pks明显的乳酸菌,分别为Levilactobacillus brevis HSDF-lbn-2022(lbn)、Lactobacillus sakei HSDF-lso-2022(qj)、Leuconostoc mesenteroides HSDF-lmo-2022(cm)、Loigolactobacillus coryniformis HSDF-lco-2022(rs)、Lactiplantibacillus xiangfangensis HSDF-lxo-2022(xf);通过乳酸菌和腐败菌在酸菜中共发酵,根据发酵液产pH、有机酸、腐败菌活菌数、生物膜形成量和生物胺情况,从5株乳酸菌中筛选出qj,其抑制pks的效果最好、pH最低(3.34)、有机酸含量最高(62.10 mg/mL)、腐败菌活菌数最少(5.00×10^(6)CFU/mL)、腐败菌生物膜形成量最少(0.021 g)、生物胺种类和含量也较少。不同的乳酸菌抑制pks的能力不同,qj有显著的抑制效果,该研究为发酵食品生物法抑制东北酸菜腐败提供了借鉴。 展开更多
关键词 清酒乳杆菌 腐败菌 库德里阿兹威毕赤酵母 酸菜
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抗菌肽在毕赤酵母中表达的研究进展 被引量：1
6
作者 查曼 闵勇 +5 位作者 刘晓艳 朱镭 邱一敏 陈凌 周荣华 王常高 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第13期354-361,共8页
抗菌肽是一类由原核生物和真核生物产生的小分子多肽,具有广谱抑菌活性,且不易引发微生物耐药性,因此被认为具有替代抗生素成为新一代抗菌药物的潜力。该文主要综述了抗菌肽的研究进展,并展望了其在医药、畜牧业、农业及食品领域中的应... 抗菌肽是一类由原核生物和真核生物产生的小分子多肽,具有广谱抑菌活性,且不易引发微生物耐药性,因此被认为具有替代抗生素成为新一代抗菌药物的潜力。该文主要综述了抗菌肽的研究进展,并展望了其在医药、畜牧业、农业及食品领域中的应用前景。此外,该文还总结了近年来抗菌肽在毕赤酵母中的重组表达研究,并探讨了提高抗菌肽在该系统中高效表达的优化策略,包括启动子、信号肽、蛋白伴侣的选择、基因剂量及发酵参数的优化。希望通过这些总结,为抗菌肽的应用开发和大规模生产提供有价值的参考。 展开更多
关键词 抗菌肽 抗生素 微生物耐药性 毕赤酵母 重组表达
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谷氨酸废液生物转化浆液发酵条件优化及促生作用
7
作者 张迎 王志刚 +2 位作者 徐伟慧 胡云龙 陈文晶 《微生物学杂志》 北大核心 2025年第2期32-42,共11页
为探寻谷氨酸废液生物转化浆液资源化利用的方向,利用酵母菌对浆液进行发酵处理。利用添加浆液的培养基筛选出一株生物量较高的酵母菌株;通过单因素试验和响应面优化试验确定了酵母菌在浆液培养基中的主要影响因素及最优发酵条件;通过... 为探寻谷氨酸废液生物转化浆液资源化利用的方向,利用酵母菌对浆液进行发酵处理。利用添加浆液的培养基筛选出一株生物量较高的酵母菌株;通过单因素试验和响应面优化试验确定了酵母菌在浆液培养基中的主要影响因素及最优发酵条件;通过浸种试验评价了发酵液对水稻、小麦、玉米的促生效果。结果表明,库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) X-1作为发酵菌株生物量最大;菌株X-1发酵的碳源种类为葡萄糖,发酵的主要影响因素为葡萄糖浓度、摇瓶装液量和培养时间;菌株X-1在浆液培养基中最优发酵条件为90 g/L的葡萄糖浓度,187 mL/250 mL的摇瓶装液量,培养时间98 h。发酵液浸种提高水稻、玉米和小麦种子的发芽率,促进根的生长。综上所述,使用浆液作为发酵底物,既可以生产酵母菌,还能促进禾本科作物的生长。相关研究的开展,为后期谷氨酸废液生物转化浆液的利用提供参考与技术支持。 展开更多
关键词 谷氨酸废液生物转化浆液 库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) 发酵条件优化 促生 种子萌发
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降解桔霉素酵母菌的筛选及降解机理初探 被引量：1
8
作者 王娅楠 陈定一 +3 位作者 匡林莎 李鑫 申家荣 王丽玲 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第6期112-119,共8页
桔霉素(citrinin,CIT)是具有肝脏毒性、肾脏毒性和细胞毒性的一种真菌毒素。为筛选出降解CIT的酵母菌,该文以新疆托木尔峰酒业酒醅及土壤、阿瓦提红葡萄为原料,经形态学鉴定共得到18株酵母菌。经初筛与复筛确定酵母菌PT降解CIT的效果最... 桔霉素(citrinin,CIT)是具有肝脏毒性、肾脏毒性和细胞毒性的一种真菌毒素。为筛选出降解CIT的酵母菌,该文以新疆托木尔峰酒业酒醅及土壤、阿瓦提红葡萄为原料,经形态学鉴定共得到18株酵母菌。经初筛与复筛确定酵母菌PT降解CIT的效果最好,通过分子生物学鉴定酵母菌PT为毕赤酵母菌属(Pichia属)。进一步研究了酵母菌PT的细胞壁、胞内代谢物和胞外代谢物对CIT降解效果的影响。结果表明,酵母菌PT的细胞壁、胞内代谢产物及胞外代谢产物均对CIT有一定的降解效果,降解率分别为21.2%、20.0%、18.8%,综合分析酵母菌PT对CIT既有细胞壁的吸附作用,也有胞内代谢物、胞外代谢物的协同作用,属于多组分协同降解。另外,酵母菌PT结合其他酵母菌对CIT的降解率基本不变,推测对CIT没有产生协同降解作用;为提高酵母菌PT对CIT的降解效果,研究了酵母菌PT结合物理吸附剂蒙脱土K-10对CIT降解效果的影响。结果表明,酵母菌培养120 h时对CIT降解效果达到73.4%。该研究筛选的酵母菌PT扩大了CIT降解菌的菌种库,为CIT的生物降解提供了一定的参考价值。 展开更多
关键词 桔霉素 毕赤酵母菌 降解组分 联合方法 鉴定
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合成GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 杂合型糖基结构糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建 被引量：1
9
作者 王昊 王甜甜 +5 位作者 张斌 吴军 徐惠芳 张燕茹 刘克海 刘波 《生物工程学报》 北大核心 2025年第9期3617-3629,共13页
糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,参与调控蛋白质半衰期、生物活性和免疫原性等,进而影响其功能。毕赤酵母表达的糖蛋白的糖基外链主要由甘露糖组成,为高甘露糖型糖基,这与哺乳动物细胞表达糖蛋白时形成的复杂型糖基不同。本研究... 糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,参与调控蛋白质半衰期、生物活性和免疫原性等,进而影响其功能。毕赤酵母表达的糖蛋白的糖基外链主要由甘露糖组成,为高甘露糖型糖基,这与哺乳动物细胞表达糖蛋白时形成的复杂型糖基不同。本研究旨在通过基因工程手段,将毕赤酵母的高甘露糖的糖基化修饰形式改造为类似于哺乳动物细胞的杂合型糖基修饰形式。基于实验室前期获得的能够形成Man8GlcNAc_(2) 糖基的?och1毕赤酵母菌,本研究进一步引入了绿色木霉来源的甘露糖苷酶Ⅰ基因MDSⅠ、人源的β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ基因GnTⅠ。同时利用强诱导型AOX启动子和组成型GAP启动子,设计不同启动子组合来调控MDSⅠ、GnTⅠ基因表达。选择中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的刺突蛋白受体结合域(receptor-binding domain,RBD)377-588作为报告蛋白(MERS-RBD),利用PNGase F酶切、质谱等方法分析报告蛋白N-糖谱。在och1基因敲除菌基础上,引入不同启动子组合的MDSⅠ、GnTⅠ基因后,均成功得到GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 糖基化修饰形式的毕赤酵母工程菌株。当利用AOX启动子控制MDSⅠ基因和GAP启动子控制GnTⅠ基因时,工程菌的N糖基化修饰以杂合型GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 糖基占比最高,为68.38%。本研究成功得到了能够合成GlcNAcMan5GlcNAc_(2) 杂合型糖基的毕赤酵母工程菌株,为后续毕赤酵母合成复杂型糖蛋白的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 毕赤酵母 糖基化 杂合型 中东呼吸综合征冠状病毒受体结合域
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毕赤酵母表达CD63单链抗体及其生物活性的鉴定 被引量：1
10
作者 陈雪丹 蔡志坚 《生物工程学报》 北大核心 2025年第4期1440-1454,共15页
为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体,本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv),纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的... 为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体,本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv),纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的CD63单克隆抗体细胞株进行可变区测序得到重链可变区(variable heavy chain,VH)与轻链可变区(variable light chain,VL),经柔性肽连接构成scFv,通过密码子优化后全基因合成CD63 scFv序列并克隆至毕赤酵母表达质粒pPICZα-A,质粒经SacI线性化后电转到毕赤酵母X33,1%甲醇诱导表达sc Fv,发酵上清通过Ni柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting进行了鉴定。通过免疫印迹、免疫荧光、基于细胞的酶联免疫吸附实验、流式细胞术对CD63 scFv的生物活性进行鉴定。本研究成功构建了能够分泌表达抗CD63 scFv的毕赤酵母菌株,抗体分子量约为30 kDa,能与CD63蛋白特异性结合。抗CD63 scFv在毕赤酵母中的表达是一种经济有效的抗体获取方法,为大规模生产抗CD63抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 CD63单链抗体 毕赤酵母 分泌表达 亲和力 特异性
原文传递
抗脲酶纳米抗体在毕赤酵母中的诱导表达
11
作者 孔静 胡钰峰 +2 位作者 郑楠 王加启 赵圣国 《动物营养学报》 北大核心 2025年第10期7054-7061,共8页
为抑制瘤胃微生物脲酶活性,降低瘤胃氮源物质的分解浪费,本试验在毕赤酵母中诱导表达1种抗脲酶纳米抗体。以瘤胃微生物脲酶为靶标,利用毕赤酵母表达系统构建含有抗瘤胃微生物脲酶的纳米抗体重组质粒,先通过小量试表达并鉴定,随后添加甲... 为抑制瘤胃微生物脲酶活性,降低瘤胃氮源物质的分解浪费,本试验在毕赤酵母中诱导表达1种抗脲酶纳米抗体。以瘤胃微生物脲酶为靶标,利用毕赤酵母表达系统构建含有抗瘤胃微生物脲酶的纳米抗体重组质粒,先通过小量试表达并鉴定,随后添加甲醇对纳米抗体进行诱导表达,使用镍离子金属鳌合亲和层析柱纯化,并检测其对瘤胃微生物脲酶的抑制效果。结果显示:本试验成功构建含有抗瘤胃微生物脲酶的纳米抗体重组质粒,运用毕赤酵母表达纯化后,获得纯度高于95%的抗脲酶纳米抗体,表达量为29 mg/L培养基。体外试验表明,该纳米抗体对瘤胃微生物脲酶活性的半数抑制浓度(IC_(50))为35μg/mL。综上可知,本试验在毕赤酵母中成功诱导表达了一种针对瘤胃微生物脲酶的特异性纳米抗体,该纳米抗体在体外能够显著抑制瘤胃微生物脲酶的活性。 展开更多
关键词 纳米抗体 瘤胃微生物脲酶 毕赤酵母 表达纯化
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抗脲酶纳米抗体在毕赤酵母中的大规模表达优化及其活性分析
12
作者 胡钰峰 张明建 +3 位作者 范伟辉 郑楠 王加启 赵圣国 《中国饲料》 北大核心 2025年第19期46-51,共6页
本试验通过毕赤酵母表达系统表达特异性靶向瘤胃微生物脲酶的纳米抗体,并检验其对脲酶活性的抑制效果,为新饲料添加剂开发提供指导。利用20 L发酵体系优化发酵条件,随后进行5000 L大规模发酵获得纳米抗体干粉;通过体外试验检测获得的纳... 本试验通过毕赤酵母表达系统表达特异性靶向瘤胃微生物脲酶的纳米抗体,并检验其对脲酶活性的抑制效果,为新饲料添加剂开发提供指导。利用20 L发酵体系优化发酵条件,随后进行5000 L大规模发酵获得纳米抗体干粉;通过体外试验检测获得的纳米抗体干粉对瘤胃微生物脲酶活性的抑制效果。试验结果表明:经20 L发酵试验确定培养基配方为葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母粉1%,氯化钠0.5%,磷酸氢二钾0.3%,氯化铁0.01%,硫酸镁0.1%,氯化钙0.1%,维生素B_(1)0.01%,补料方案为发酵16 h后开始补加560 L 50%葡萄糖,补料速度28 L/h;20 L与5000 L发酵所得到的纳米抗体对瘤胃微生物脲酶的IC_(50)分别为7.417μg/mL和7.950μg/mL。本试验通过高密度发酵工艺在毕赤酵母中成功表达了一种特异性靶向瘤胃微生物脲酶的纳米抗体,并在体外试验中验证了其对瘤胃微生物脲酶活性的抑制效果。 展开更多
关键词 脲酶抑制剂 纳米抗体 毕赤酵母 高密度发酵 瘤胃
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毕赤酵母Ku70基因缺失对(-)-α-红没药醇合成的影响
13
作者 蒋雨红 邱世骥 +4 位作者 胡蝶 周培鹏 廖清 刘文宗 胡晓清 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第15期9-14,共6页
(-)-α-红没药醇[(-)-α-bisabolol,BO]具有抗炎、抗菌和改善皮肤的作用,在制药和化妆品等领域应用广泛,因此BO的微生物合成具有重要前景。目前在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母均有BO合成报道,其代谢工程改造策略包括... (-)-α-红没药醇[(-)-α-bisabolol,BO]具有抗炎、抗菌和改善皮肤的作用,在制药和化妆品等领域应用广泛,因此BO的微生物合成具有重要前景。目前在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母均有BO合成报道,其代谢工程改造策略包括:强化甲羟戊酸途径和β-氧化途径、提高乙酰辅酶A供给、弱化竞争途径等。基于此,该研究首次在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中合成BO,并评价了敲除Ku70(编码非同源末端连接的DNA修复)这一新策略对BO合成的影响。首先将MrBBs(编码BO合成酶)转化GS115,构建GS115/pPICZ A-MrBBs,添加正十二烷进行两相培养,132 h后BO合成量达到3.11 mg/L;然后利用pPpT4质粒敲除GS115的Ku70基因,获得GS115ΔKu70,并构建GS115ΔKu70/pPICZ A-MrBBs,培养132 h后,BO的产量相较GS115/pPICZ A-MrBBs增加了15.95倍,达到83.22 mg/L,显示Ku70基因缺失可显著提高BO合成。该研究显示P.pastoris具有合成BO的潜力,Ku70缺失可大幅提升BO合成水平,为进一步代谢工程改造奠定了坚实基础。 展开更多
关键词 毕赤酵母 (-)-α-红没药醇 敲除 KU70 MrBBs
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酸菜中腐败酵母菌分离、鉴定及其特性的研究
14
作者 陀小莉 茜琳 +2 位作者 赵凯 石彦国 范洪臣 《中国调味品》 北大核心 2025年第9期93-101,147,共10页
从变质酸菜中分离腐败菌并进行鉴定,主要腐败菌为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)HSDF-pks-2022(pks),pks能够在高酸、高盐和营养匮乏的情况下利用乳酸生长繁殖形成腐败生物膜,使pH升高,可能导致其他腐败菌生长,产纤维素酶... 从变质酸菜中分离腐败菌并进行鉴定,主要腐败菌为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)HSDF-pks-2022(pks),pks能够在高酸、高盐和营养匮乏的情况下利用乳酸生长繁殖形成腐败生物膜,使pH升高,可能导致其他腐败菌生长,产纤维素酶、不良风味物质、生物胺,从而导致酸菜的口感、风味和食用安全性下降。发酵特性结果表明,pks具有产酸能力,能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉、七叶苷和乳酸等代谢物;pks嗜氧,4℃低温下也可存活,活菌数可达到3.00×10^(6)CFU/mL;pks能在高酸条件下生长,pH为3时活菌数可达74.00×10^(6)CFU/mL;pks能在高盐浓度下生长,盐浓度为10%时活菌数可达69.50×10^(6)CFU/mL。腐败特性表明,pks具有产气、产胺、产膜、产黏性和产纤维素酶的能力,在有氧条件下酮类和硫化物等是造成酸菜产生异味的主要化合物。 展开更多
关键词 酸菜 腐败酵母菌 库德里阿兹威毕赤酵母 腐败特性 挥发性风味物质
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毕赤酵母利用甲醇生产重组蛋白技术的研究进展
15
作者 王媛媛 张翀 +1 位作者 韩双艳 邢新会 《化工进展》 北大核心 2025年第5期2441-2450,共10页
甲醇等一碳化合物作为生物制造的一种绿色可持续低碳原料,不存在与人争粮的问题,具有巨大的应用发展潜力。能够天然利用甲醇的毕赤酵母研究历史长,已被广泛应用于多种重组蛋白的生物制造中,成为甲醇利用性能优良的底盘细胞工厂。近年虽... 甲醇等一碳化合物作为生物制造的一种绿色可持续低碳原料,不存在与人争粮的问题,具有巨大的应用发展潜力。能够天然利用甲醇的毕赤酵母研究历史长,已被广泛应用于多种重组蛋白的生物制造中,成为甲醇利用性能优良的底盘细胞工厂。近年虽然对毕赤酵母的生理学、甲醇代谢网络、蛋白分泌表达途径及关键元件挖掘开展了大量的研究,积累了大量知识,但仍存在影响其高效应用的一系列关键问题,如甲醇及其代谢物对细胞毒性的复杂影响机制认知有限、细胞鲁棒性及甲醇利用相关的“生命暗物质”挖掘能力不足、甲醇高效转化成目标蛋白的工程化手段有限等。本文综述了国内外有关毕赤酵母生物转化甲醇合成重组蛋白的研究现状,重点总结讨论了毕赤酵母细胞工厂转化甲醇及蛋白表达优化策略,最后探讨了当前毕赤酵母生物转化甲醇生产重组蛋白过程中面临的挑战,并对其未来的生物技术创新和应用进行了展望。 展开更多
关键词 甲醇 毕赤酵母 重组蛋白 代谢工程 合成生物学
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土曲霉阿魏酸酯酶异源表达、酶学性质及在阿魏酸制备中的应用
16
作者 韩红祥 郭成城 +2 位作者 魏胜华 陈阿娜 李松 《食品科学》 北大核心 2025年第15期155-163,共9页
为提高阿魏酸酯酶(ferulic esterase,FAE)的发酵单位活力,将土曲霉FAE编码基因在毕赤酵母实现异源高效表达。重组毕赤酵母发酵活力为(17.38±0.34)U/mL,是原始菌株的35倍左右。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验得出,重组土... 为提高阿魏酸酯酶(ferulic esterase,FAE)的发酵单位活力,将土曲霉FAE编码基因在毕赤酵母实现异源高效表达。重组毕赤酵母发酵活力为(17.38±0.34)U/mL,是原始菌株的35倍左右。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验得出,重组土曲霉阿魏酸酯酶(recombinant Aspergillus terreus ferulic esterase,rAtFAE)分子质量约为39 kDa。酶学性质研究表明rAtFAE最适pH值为6.0、最适反应温度为50℃,以咖啡酸甲酯、香豆酸甲酯、阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯为底物时测得的kcat/Km值分别为255、237、112.64、96.85 L/(mol·min)。在以麸皮为原料制备阿魏酸的应用实验中,rAtFAE可以与木聚糖酶产生良好的协同作用并有效提升阿魏酸的释放量,最大释放量为(1 876.45±30.05)μg/g(以麸皮质量计)。 展开更多
关键词 土曲霉 阿魏酸酯酶 异源表达 毕赤酵母 阿魏酸
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玉米大斑病菌纤维素酶基因StCEL1克隆表达及其编码蛋白致病性分析
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作者 马周杰 张楠 +4 位作者 高增贵 温胜慧 杨俊伟 王建军 赵变平 《核农学报》 北大核心 2025年第11期2342-2350,共9页
为了探究玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)纤维素酶及其关键编码基因在致病过程中的功能,本研究以菌株YD001为材料克隆了纤维素酶基因StCEL1并进行了生物信息学分析,构建了pPIC9K/StCEL1重组质粒并转入毕赤酵母中成功表达,随后分析... 为了探究玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)纤维素酶及其关键编码基因在致病过程中的功能,本研究以菌株YD001为材料克隆了纤维素酶基因StCEL1并进行了生物信息学分析,构建了pPIC9K/StCEL1重组质粒并转入毕赤酵母中成功表达,随后分析了重组蛋白的酶学性质以及致病性。结果表明,StCEL1基因全长1308 bp,包含1个内含子,可编码410个氨基酸,蛋白分子量为44.07 kDa,理论等电点为8.19,该蛋白为亲水性蛋白,具有信号肽,不存在跨膜结构。结构域和二级结构分析结果显示,StCEL1蛋白具有明显的保守结构域,属于糖苷水解酶7-纤维二糖水解酶-内切葡聚糖苷酶超级家族,二级结构中无规则卷曲含量最高。StCEL1基因在毕赤酵母中表达,获得一个分子量约为66 kDa的重组蛋白,该蛋白在1.0%甲醇浓度下诱导96 h效果最佳;酶活性的最适反应温度为55℃,最适反应pH值为4.0,最佳反应时间为30 min;接种玉米幼苗表现出明显病斑,表明纤维素酶基因StCEL1可能与玉米大斑病菌的致病性相关。本研究结果为进一步揭示StCEL1蛋白在玉米大斑病菌致病性中的作用机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 玉米大斑病菌 纤维素酶 基因克隆 毕赤酵母 致病性
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毕赤酵母高效间接表面展示系统的构建及在固定有机磷水解酶上的应用
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作者 赵梓萱 王淋 +4 位作者 王艳丽 袁慧 贺妮莎 张桂敏 周玉玲 《微生物学报》 北大核心 2025年第9期4014-4028,共15页
【目的】通过毕赤酵母表面展示技术,利用SpyCatcher/SpyTag(SpyC/SpyT)生物偶联体系固定有机磷水解酶(organophosphorus hydrolase,OPH),以解决OPH在实际应用中稳定性差和重复利用率低的问题,为有机磷农药污染的生物修复提供新方法。【... 【目的】通过毕赤酵母表面展示技术,利用SpyCatcher/SpyTag(SpyC/SpyT)生物偶联体系固定有机磷水解酶(organophosphorus hydrolase,OPH),以解决OPH在实际应用中稳定性差和重复利用率低的问题,为有机磷农药污染的生物修复提供新方法。【方法】在毕赤酵母表面展示“诱饵蛋白”SpyCatcher(SpyC),通过增加拷贝数和优化培养条件提高展示效率。通过酶学性质分析评估固定化OPH的热稳定性、pH稳定性及重复使用性能,并考察其对基于SpyC/SpyT的特异性相互作用,将OPH-SpyTag(OPH-SpyT)高效展示于毕赤酵母表面。甲基对硫磷、乐果和毒死蜱3种有机磷农药的水解效率。【结果】毕赤酵母表面展示SpyC的效率超过(97.0±0.40)%,优化后湿细胞可结合绿色荧光蛋白(21.4±0.7)mg/g。成功将OPH展示于细胞表面,固定化OPH的热稳定性和pH稳定性显著提高,重复使用5次后仍保留50%以上的活力。在最适条件下,对100 mg/L甲基对硫磷、乐果和毒死蜱这3种有机磷农药的水解率分别达到(96.5±2.7)%、(79.5±2.3)%和(82.6±2.8)%,表明该方法对某些有机磷农药具有较高的水解效率。【结论】SpyC/SpyT生物偶联体系的毕赤酵母表面展示技术可有效固定OPH,显著提升其稳定性和重复使用性能,为有机磷农药污染的生物修复提供了高效、绿色的新途径,也为毕赤酵母表面展示相关领域的研究提供了有力工具和方法。 展开更多
关键词 SpyCather/SpyTag 毕赤酵母 间接表面展示 有机磷水解酶
原文传递
刚地弓形虫GRA23基因在毕赤酵母系统中的表达鉴定
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作者 范学伟 张西臣 +1 位作者 张楠 姜鑫 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期88-92,共5页
为了对弓形虫致密颗粒蛋白GRA23进行毕赤酵母真核系统表达,试验首先提取弓形虫的总RNA,反转录为cDNA;以cDNA为模板扩增GRA23基因,将其与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接构建重组质粒pPIC9K-GRA23,将其线性化后转化至GS115感受态细胞;然后采... 为了对弓形虫致密颗粒蛋白GRA23进行毕赤酵母真核系统表达,试验首先提取弓形虫的总RNA,反转录为cDNA;以cDNA为模板扩增GRA23基因,将其与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接构建重组质粒pPIC9K-GRA23,将其线性化后转化至GS115感受态细胞;然后采用PCR方法筛选阳性转化子,利用遗传霉素(G418)筛选高拷贝酵母重组菌株,经1%甲醇诱导表达后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定。结果表明:PCR扩增得到大小为657 bp的GRA23基因,重组质粒pPIC9K-GRA23经双酶切得到9300 bp大小的pPIC9K载体条带和GRA23目的基因条带。重组菌株经甲醇诱导120 h后,得到目的条带大小为30 ku的GRA23蛋白,符合预期,且制备的蛋白可被His单克隆抗体特异性识别。说明弓形虫GRA23基因在毕赤酵母系统成功表达。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 GRA23基因 PPIC9K 毕赤酵母 表型鉴定 真核表达
原文传递
豆豉纤溶酶基因的异源表达及其重组菌在淡豆豉中的应用
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作者 徐菁雯 乌日娜 +8 位作者 王伟明 阎亦然 向雪琴 赵玉莲 武俊瑞 王亚琦 邓丽 童星 史海粟 《食品科学》 北大核心 2025年第4期68-80,共13页
从不同来源及不同发酵阶段的淡豆豉中分离筛选出65株优势菌,通过酶联免疫吸附法测定纤溶酶活性,得到一株高产纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)20-1,并扩增其纤溶酶基因,在毕赤酵母中异源表达,获得高产纤溶酶的重组菌株Pichi... 从不同来源及不同发酵阶段的淡豆豉中分离筛选出65株优势菌,通过酶联免疫吸附法测定纤溶酶活性,得到一株高产纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)20-1,并扩增其纤溶酶基因,在毕赤酵母中异源表达,获得高产纤溶酶的重组菌株Pichia pastoris pPIC9K-his-aprEBS2,重组菌中该基因表达水平是出发菌株的5.8倍,培养48 h后纤溶酶活性达到(3 025.59±201.27)U/mL,是出发菌株的8.9倍;经优化,其活性可达(8 698.24±180.73)U/mL。通过急性毒性实验证明,该重组菌无毒。利用该重组菌纯种发酵淡豆豉,淡豆豉中纤溶酶活性达到(17 287.02±103.20)U/g,通过理化指标监测、感官特性分析及电子舌分析,重组菌可以提高淡豆豉的感官及风味。重组菌发酵的淡豆豉成品血栓溶解率可达到(60.55±1.58)%,高于市售淡豆豉。 展开更多
关键词 豆豉纤溶酶 异源表达 毕赤酵母 淡豆豉
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