pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

1

作者 王立林 严世荣 +2 位作者 汪炳华 王家宁 黄永章 《药物生物技术》 CAS CSCD 2005年第5期285-290,共6页

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合... 构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。 展开更多

关键词 细胞穿膜肽 pep-1 pep-1-p27mt融合蛋白 pET15b-pep-1-p27mt 重组表达子 抑癌基因

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PEP-1-CAT减轻H9c2细胞缺氧复氧损伤与抑制p38MAKP信号通路有关 被引量：1

2

作者 魏双 王宣人 +4 位作者 郑飞 王露 郭凌郧 张蕾 王家宁 《湖北医药学院学报》 2025年第1期9-13,27,F0002,共7页

目的:探讨细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶(CAT)对H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用及其可能的机制。方法:利用基因工程手段表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白。将H9c2细胞随机分为正常对照组(CTL组)、缺氧复氧组(H/R... 目的:探讨细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶(CAT)对H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用及其可能的机制。方法:利用基因工程手段表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白。将H9c2细胞随机分为正常对照组(CTL组)、缺氧复氧组(H/R组)、H/R加CAT组(CAT组)、H/R加PEP-1-CAT组(PEP-1-CAT组)。分别向PEP-1-CAT组及CAT组加入2 mol/L的PEP-1-CAT及CAT蛋白500μL处理6 h,将各组细胞置于缺氧箱中缺氧21 h,再复氧6 h,通过CCK-8法监测细胞的增殖率,流式细胞仪检测细胞的凋亡水平和活性氧(ROS)的水平,DCFH-DA探针检测细胞内的ROS变化水平,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化。Western blot分析凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及p-p38表达量的变化。结果:与H/R组相比,PEP-1-CAT组细胞凋亡率、细胞内ROS水平、Bax、Caspase-3及p-p38表达量均明显下降(P<0.05),细胞增殖率、细胞内线粒体膜电位水平及Bcl-2的表达量升高(P<0.05)。结论:PEP-1-CAT对H9c2细胞缺氧复氧损伤有保护作用,推测机制可能与其抗氧化、抗凋亡作用有关,PEP-1-CAT可通过抑制p38MAPK信号通路阻断Bcl-2/Bax/线粒体凋亡通路。 展开更多

关键词 pep-1肽 过氧化氢酶 缺氧复氧 细胞凋亡 ROS 线粒体膜电位 P38MAPK

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血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1的制备及在大鼠H9c2心肌细胞的转导 被引量：10

3

作者 颜学滔 王焱林 +2 位作者 王家宁 王成夭 何祥虎 《武汉大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2010年第4期421-425,F0002,共6页

目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白PEP-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,... 目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白PEP-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白PEP-1-HO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠H9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在H9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hHO-1 cDNA与pET15b-PEP-1重组成功,重组质粒pET15b-PEP-1-hHO-1经酶切鉴定含有hHO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透H9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-PEP-1-hHO-1原核表达质粒,获得了可穿透H9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1,为应用HO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 血红素加氧酶-1 pep-1肽 融合蛋白 蛋白转导 H9C2细胞

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PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化 被引量：7

4

作者 丁鹏 王家宁 +2 位作者 杨波 黄永章 骆丽娜 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2006年第3期240-243,共4页

目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21... 目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。 展开更多

关键词 铜 锌-超氧化物歧化酶 原核表达 TA克隆 pep-1肽 融合蛋白

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原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建 被引量：9

5

作者 丁鹏 王家宁 +1 位作者 黄永章 杨波 《新乡医学院学报》 CAS 2006年第2期141-144,共4页

目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载... 目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。 展开更多

关键词 铜 锌-超氧化物歧化酶 TA克隆 基因重组 蛋白转导域 pep-1肽

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细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导 被引量：7

6

作者 董晓 王家宁 +4 位作者 唐俊明 潘国栋 黄永章 杨建业 曹书芬 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2007年第7期798-801,共4页

目的研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力。方法用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻... 目的研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力。方法用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察。结果2 h后PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光。结论细胞穿透肽PEP-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用PEP-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据。 展开更多

关键词 细胞穿透肽 蛋白转导域 蛋白转导 pep-1 增强型绿色荧光蛋白

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PEP-1肽介导人Cu,Zn-SOD转导入大鼠离体缺血再灌注损伤心脏 被引量：5

7

作者 柯尊平 王家宁 +4 位作者 郭凌郧 唐俊明 黄永章 王磊 杨建业 《武汉大学学报(医学版)》 CAS 2007年第4期450-455,I0001,共7页

目的:构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,观察PEP-1-SOD1融合蛋白在大鼠离体缺血再灌注损伤心肌组织内的转导能力和转导的目的蛋白是否具有酶活性。方法:构建原核表达载体pET15 b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化... 目的:构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,观察PEP-1-SOD1融合蛋白在大鼠离体缺血再灌注损伤心肌组织内的转导能力和转导的目的蛋白是否具有酶活性。方法:构建原核表达载体pET15 b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白。采用Langendorff灌流系统,大鼠离体心脏停灌30 min后复灌60 min建立缺血再灌注损伤模型。实验分为对照组,SOD1组,25,50,100μmol/L PEP-1-SOD1组。免疫荧光检测PEP-1-SOD1的转导效果,SOD试剂盒检测酶活性。结果:在荧光显微镜下,PEP-1-SOD1融合蛋白预处理组心肌组织中可见特异性的绿色荧光位于心肌细胞胞质内,25,50,100μmol/L组阳性率分别为32.6%,42.5%,60.9%。SOD1蛋白预处理组和对照组未见到绿色荧光。与对照组相比,PEP-1-SOD1各组SOD酶活性均显著增加(P<0.01),且SOD酶活性与PEP-1-SOD1浓度呈正相关,SOD1组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白以天然有活性的形式穿透进入大鼠离体缺血再灌注损伤的心肌细胞,且具有剂量依赖性。转导入细胞内的PEP-1-SOD1蛋白具有酶活性。本研究为SOD1治疗由氧化应激所导致的各种疾病提供了一种有效的递送途径。 展开更多

关键词 pep-1肽 铜 锌-超氧化物歧化酶 蛋白转导 心肌细胞 缺血再灌注损伤

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神经干细胞移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤大鼠神经功能恢复的影响 被引量：5

8

作者 贾进明 陈菲菲 +1 位作者 吴云飞 赵卫忠 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1511-1516,共6页

目的：探讨神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤后大鼠神经功能恢复的影响。方法：SD雄性大鼠80只,建立颅脑损伤模型后随机分为4组：对照组（损伤处注入生理盐水）、NSCs移植组（损伤处注入NSCs悬液）、S... 目的：探讨神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤后大鼠神经功能恢复的影响。方法：SD雄性大鼠80只,建立颅脑损伤模型后随机分为4组：对照组（损伤处注入生理盐水）、NSCs移植组（损伤处注入NSCs悬液）、SOD1组（损伤处注入PEP-1-SOD1蛋白）及NSCs＋SOD1组（损伤处注入NSCs悬液＋PEP-1-SOD1蛋白）。4 d后采用定量PCR及Western blot法分别检测小鼠脑组织中AQP4基因表达及蛋白合成变化;分别于损伤后1、3 d和1、2、3、4周行Bederson评分,损伤后23-28 d行Morris水迷宫试验对大鼠运动神经功能进行评价;伤后第4周取材行病理切片Brd U免疫组织化学染色。结果：脑损伤后4 d,对照组脑损伤周围组织AQP4及其m RNA的表达高于NSCs移植组及SOD1组,NSCs移植组及SOD1组均高于NSCs＋SOD1组（P〈0.05）。分别于损伤后1、3 d及1、2、3、4周行Bederson评分显示4周时各组大鼠Bederson评分均低于24 h,并且4周时Bederson评分NSCs＋SOD1组低于对照组（P〈0.05）。Morris水迷宫试验结果显示NSCs＋SOD1组神经功能改善较对照组明显（P〈0.05）。免疫组化染色结果显示NSCs＋SOD1组大鼠损伤灶脑组织中的Brd U阳性细胞数高于NSCs移植组、SOD1组和对照组（P〈0.05）。结论：神经干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用PEP-1-SOD1有协同效果。 展开更多

关键词 颅脑损伤 神经干细胞 pep-1-SOD1 神经功能恢复 大鼠

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PEP-1肽介导人Cu,ZnSOD转导入人脐静脉内皮细胞 被引量：10

9

作者 丁鹏 王家宁 +2 位作者 黄永章 骆丽娜 邵芳 《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第9期855-859,共5页

目的:构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,观察表达的融合蛋白PEP1SOD1能否进入细胞.方法:以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA.经酶切后分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,分别转化大肠杆菌,表达SOD1和PEP1SOD... 目的:构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,观察表达的融合蛋白PEP1SOD1能否进入细胞.方法:以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA.经酶切后分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,分别转化大肠杆菌,表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,将鉴定和纯化后的融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞.结果:得到高纯度的、有活性的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白.PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,并表现出剂量依赖性和时间依赖性的特点;一旦进入细胞,PEP1SOD1融合蛋白可以维持48h.结论:PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,为SOD1进入组织细胞内发挥治疗作用提供了实验基础. 展开更多

关键词 超氧化物歧化酶 原核表 pep-1肽 融合蛋白

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细胞穿透肽PEP-1介导人过氧化氢酶转导入在体大鼠心肌组织 被引量：4

10

作者 张永军 王家宁 +3 位作者 唐俊明 杨建业 郭凌郧 黄永章 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第3期225-228,共4页

目的:观察PEP-1介导CAT转导入心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性.方法:用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白.以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24 h时... 目的:观察PEP-1介导CAT转导入心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性.方法:用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白.以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24 h时将其处死,取其心脏,免疫荧光及Western Blot检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性.结果:SDS-PAGE和Western Blot证实目的蛋白PEP-1-CAT和CAT得到了高表达,且纯度在90%左右.生理盐水组及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光,Western Blot亦未检测到目的蛋白;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8 h时强度最大,同时Western Blot也检测到了目的蛋白,8 h时量最多;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别无统计学意义,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8 h时达到峰值,为对照组的4.20倍.结论:PEP-1能够介导CAT以天然活性方式转导入大鼠心肌组织,且其转导呈时间依赖性. 展开更多

关键词 pep-1 过氧化氢酶 心肌再灌注损伤 转导 在体

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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入小鼠海马组织的能力及时间关系 被引量：5

11

作者 董敏 席刚明 +1 位作者 张正洪 王家宁 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第13期1184-1187,共4页

目的:研究PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD1)转导入小鼠海马组织的能力及时间关系.方法:健康雄性昆明小鼠随机分为SOD1组及PEP-1-SOD1组,分别经腹腔注射SOD1蛋白及PEP-1-SOD1融合蛋白200μg,于注射后1,2,4,8,24h等5个时间点分... 目的:研究PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD1)转导入小鼠海马组织的能力及时间关系.方法:健康雄性昆明小鼠随机分为SOD1组及PEP-1-SOD1组,分别经腹腔注射SOD1蛋白及PEP-1-SOD1融合蛋白200μg,于注射后1,2,4,8,24h等5个时间点分别取小鼠海马组织进行检测(n=5).Western Blot测定PEP-1-SOD1蛋白的表达;免疫荧光组织化学方法测定PEP-1-SOD1在海马组织的分布;黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后1h,小鼠海马组织在Mr约26×103处出现目的蛋白条带,4h达高峰,24h仍有蛋白转导;SOD1组未发现目的蛋白.免疫荧光检测发现PEP-1-SOD1组海马组织中出现特异性绿色荧光;SOD1组未发现绿色荧光.PEP-1-SOD1组酶活性于注射后1h升高至(61.7±2.9)×103U/g,4h达峰值(82.6±4.2)×103U/g,之后开始下降,24h仍明显高于SOD1处理组(P<0.01);SOD1组酶活性各时间点相比较差异无统计学意义.结论:PEP-1可以介导SOD1以天然活性形式转导进入小鼠海马组织,4h达高峰,并保持活性至少达24h. 展开更多

关键词 pep-1肽 铜 锌-超氧化物歧化酶 蛋白转导

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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性 被引量：3

12

作者 张友恩 王家宁 +5 位作者 唐俊明 郭凌郧 杨建业 黄永章 郑飞 孔霞 《第四军医大学学报》 北大核心 2008年第19期1788-1791,共4页

目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导进入大鼠心肌组织的能力,并测定转导的目的蛋白酶活性.方法:实验分为SOD1组和PEP-1-SOD1组,分别经大鼠尾静脉注射500μg纯化后的SOD1及500μg纯化后的PEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于注射后0.5,1,2,4,8... 目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导进入大鼠心肌组织的能力,并测定转导的目的蛋白酶活性.方法:实验分为SOD1组和PEP-1-SOD1组,分别经大鼠尾静脉注射500μg纯化后的SOD1及500μg纯化后的PEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于注射后0.5,1,2,4,8,24h时间点取心脏(n=6,每组,每个时间点),经40g/L多聚甲醛溶液固定6h后行冰冻切片,通过免疫组织化学方法检测PEP-1-SOD1进入大鼠心肌组织的能力和分布情况.黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后0.5h时,大鼠心肌组织中即出现均一的明亮红色荧光信号,分布于细胞浆及细胞核,具有时间依赖性的特点,荧光强度最强点为1h时间点,而SOD1组未见到红色荧光信号.于注射后0.5h时SOD1活性开始升高PEP-1-SOD1组为(85.37±1.67),SOD1组为(52.23±0.67),两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01);注射后1h时SOD1活性可达高峰,PEP-1-SOD1组为(119.16±1.37),SOD1组为(53.47±1.02),两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01),2～24h逐步下降;SOD1组各时间点间相比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:PEP-1-SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导入大鼠心肌组织,并保持酶活性达24h. 展开更多

关键词 细胞穿透肽 pep-1肽 超氧化物歧化酶

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PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 被引量：1

13

作者 张永军 王家宁 +3 位作者 唐俊明 黄永章 杨建业 郭凌郧 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期2429-2432,共4页

目的观察细胞穿透肽PEP-1介导CAT转导入在体大鼠心肌组织的能力,探究PEP-1-CAT融合蛋白对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μgPEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24h时将其处... 目的观察细胞穿透肽PEP-1介导CAT转导入在体大鼠心肌组织的能力,探究PEP-1-CAT融合蛋白对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μgPEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性。40只SPF级雄性SD大鼠,随机分为5组,假手术组,心肌缺血再灌注组,100μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组,300μgEP-1-CAT融合蛋白预处理组,500μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组。结扎冠状动脉前降支1h,再灌注2h末,检测血中的LDH和CK活性以及心肌组织内的MDA含量。结果生理盐水组以及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别没有统计学意义(P>0.05),而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4.20倍。PEP-1-CAT各剂量组均能显著减少血清中LDH和CK活性和心肌组织的MDA含量(P<0.01)。结论PEP-1能够介导CAT以时间依赖的方式转导入在体大鼠心肌组织,转导入大鼠心肌组织内的CAT具有相应的酶活性;PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,为临床应用PEP-1-CAT融合蛋白防治心肌缺血再灌注损伤奠定了实验基础。 展开更多

关键词 pep-1肽 过氧化氢酶 转导 氧化应激 心肌 缺血再灌注损伤

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PEP-1-SOD1预处理对脑梗死后小鼠海马神经元的保护 被引量：2

14

作者 董敏 席刚明 张正洪 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1487-1488,1491,I0001,共4页

目的研究PEP-1-铜,锌超氧化物歧化酶(PEP-1-SOD1)预处理对脑梗死后小鼠海马神经元的保护作用。方法健康雄性成年昆明小鼠随机分为假手术组、模型组以及PEP-1-SOD1预处理组。线栓法制作永久性大脑中动脉闭塞(PMCAO)模型。假手术组以及模... 目的研究PEP-1-铜,锌超氧化物歧化酶(PEP-1-SOD1)预处理对脑梗死后小鼠海马神经元的保护作用。方法健康雄性成年昆明小鼠随机分为假手术组、模型组以及PEP-1-SOD1预处理组。线栓法制作永久性大脑中动脉闭塞(PMCAO)模型。假手术组以及模型组在手术前30min腹腔注射生理盐水200μL,PEP-1-SOD1预处理组手术前30min注射PEP-1-SOD1200μg。手术后24h分离梗死侧海马组织,TUNEL染色测定细胞凋亡,黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性,TBA法测定丙二醛(MDA)含量。结果手术后24h与模型组相比,PEP-1-SOD1预处理组凋亡细胞数量明显减少(P<0.01),SOD1活性升高,MDA含量下降(P<0.05)。结论 PEP-1-SOD1预处理可以有效减轻小鼠脑梗死后海马神经元损伤。 展开更多

关键词 pep-1-SOD1 脑梗死 保护作用

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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及酶活性 被引量：2

15

作者 张友恩 王家宁 +4 位作者 唐俊明 杨建业 郭凌郧 黄永章 付守芝 《肝胆外科杂志》 2008年第6期460-463,共4页

目的研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及其酶活性。方法实验分为SOD1组和PEP1-SOD1组,分别经尾静脉注射500μgSOD1和500μgPEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于0.5,1,2,4,8和24h时间点取肝脏(n=6,每组,每个时间点)。免疫荧... 目的研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及其酶活性。方法实验分为SOD1组和PEP1-SOD1组,分别经尾静脉注射500μgSOD1和500μgPEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于0.5,1,2,4,8和24h时间点取肝脏(n=6,每组,每个时间点)。免疫荧光技术检测PEP-1-SOD1的转导能力。黄嘌呤氧化酶法测定肝脏组织SOD1活性。结果SOD1蛋白不能进入肝脏组织内。PEP-1-SOD1可转导入肝脏组织内,SOD1活性于注射后0.5h开始升高,1h达高峰,持续存在达24h,两组各个时间点比较,差异有统计学意义(P<0.01)。SOD1组内各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论PEP-1-SOD1以天然酶活性形式转导入肝脏组织,为进一步的动物模型实验及临床疾病进行蛋白质治疗提供理论基础。 展开更多

关键词 细胞穿透肽 pep-1肽 肝 缺血再灌注损伤 铜 锌-超氧化物歧化酶

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PEP-1介导的血红素氧合酶-1在大鼠肝脏缺血／再灌注损伤中的抗凋亡作用 被引量：2

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作者 涂华华 王卫星 +3 位作者 陈先祥 蔡庆和 何志军 曾天才 《临床外科杂志》 2012年第10期700-702,共3页

目的探讨PEP-1介导的血红素氧合酶-1（HO-1）在SD大鼠肝脏缺血／再灌注损伤中的抗凋亡作用。方法按照随机对照原则将30只大鼠分成三组，假手术组（S组）、缺血／再灌注组（IR组）、PEP—WHO-1处理＋缺血／再灌注组（PEP—1组）。在肝缺... 目的探讨PEP-1介导的血红素氧合酶-1（HO-1）在SD大鼠肝脏缺血／再灌注损伤中的抗凋亡作用。方法按照随机对照原则将30只大鼠分成三组，假手术组（S组）、缺血／再灌注组（IR组）、PEP—WHO-1处理＋缺血／再灌注组（PEP—1组）。在肝缺血40min再灌注6h后，在无菌条件下开腹解剖出肝脏，光镜下明确病理变化；免疫组织化学SP法检测HO-1蛋白表达；TUNEL法和流式细胞仪检测肝细胞凋亡细胞表现及凋亡率；Western blot检测Bcl-2和Caspase-3的表达。结果PEP-1组的肝缺血／再灌注损伤HE病理表现明显较IR组减轻，HO-1蛋白表达和Bcl-2的表达PEP-1组较IR组高，凋亡率和Caspase-3的表达PEP-1组较IR组低，两组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HO-1在供肝缺血／再灌注损伤中是通过多途径发挥抗凋亡保护作用的，PEP-1介导的HO-1融合蛋白预处理能够明显减轻肝脏缺血再灌注损伤。 展开更多

关键词 pep-1介导的血红素氧合酶 肝脏缺血 再灌注损伤 抗凋亡作用

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PEP-1-VP3融合蛋白的分离纯化与初步鉴定 被引量：1

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作者 蔡召忠 陈萍 邓守恒 《华西药学杂志》 CAS CSCD 2015年第2期160-162,共3页

目的构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体p ET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒p ET15b-PEP-1-VP3,经测序证实... 目的构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体p ET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒p ET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了17.6k D的PEP-1-VP3融合蛋白。结论所构建的PEP-1-VP3融合蛋白为体内抗肿瘤研究提供了理论基础。 展开更多

关键词 pep-1-VP3融合蛋白 分离 纯化 诱导表达 克隆 鉴定

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PEP-1介导血红素加氧酶-1导入肝细胞的实验研究 被引量：1

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作者 曾天才 王卫星 +4 位作者 陈先祥 唐俊明 郭凌郧 郑飞 张林菲 《西部医学》 2011年第3期411-414,418,共5页

目的采用体外培养的L02肝细胞株,研究PEP-1肽介导血红素加氧酶-1(PEP-1-HO-1)穿透肝细胞的能力。方法实验分为PEP-1-HO-1组和HO-1组,用基因工程的方法制备并纯化PEP-1-HO-1融合蛋白,将纯化的目的蛋白及HO-1蛋白加入培养的L02肝细胞,通... 目的采用体外培养的L02肝细胞株,研究PEP-1肽介导血红素加氧酶-1(PEP-1-HO-1)穿透肝细胞的能力。方法实验分为PEP-1-HO-1组和HO-1组,用基因工程的方法制备并纯化PEP-1-HO-1融合蛋白,将纯化的目的蛋白及HO-1蛋白加入培养的L02肝细胞,通过免疫荧光及western blot来分析其转导能力。结果经测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-HO-1重组成功。SDS-PAGE及western blot结果表明,PEP-1-HO-1在Rosetta(DE3)pLysS菌中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,将其加入到体外培养的L02肝细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能持续稳定表达48h,免疫组化显示其主要分布于胞质和胞核中。结论 PEP-1-HO-1融合蛋白能高效地转导入培养肝细胞,为进一步研究肝细胞氧化应激损伤防治的动物模型实验提供了新的途径。 展开更多

关键词 血红素加氧酶 pep-1肽 蛋白转导 肝细胞

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细胞穿透肽PEP-1在蛋白转导中的应用 被引量：1

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作者 董晓 王家宁 《药物生物技术》 CAS CSCD 2007年第2期146-148,共3页

文章对细胞穿透肽PEP-1在大分子物质体内外跨膜转导中的应用进行了综述,为进一步研究PEP-1介导有潜在治疗价值的大分子物质跨膜转导进行疾病的蛋白治疗提供了依据。

关键词 细胞穿透肽 蛋白转导域 pep-1 蛋白转导 蛋白治疗

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利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒 被引量：9

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作者 姚玲玲 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《郧阳医学院学报》 2006年第1期1-5,F0002,共6页

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长... 目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。 展开更多

关键词 同尾酶 过氧化氢酶 TA克隆 DNA重组 pep-1肽

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