二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析 被引量：10

1

作者 王建丽 郑玉玲 +3 位作者 王保莉 郭霭光 马茹 姜永强 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期74-77,共4页

目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-... 目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。 展开更多

关键词 单克隆抗体 B3 二硫键稳定单链抗体 pe38 肿瘤导向

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重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL免疫毒素的构建、表达及纯化 被引量：2

2

作者 朱晓娟 冯振卿 +5 位作者 朱进 张秀华 缪林 季国忠 范志宁 刘政 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期920-924,共5页

目的:构建绿脓杆菌外毒素PE38KDEL融合全人源抗c-Met单链抗体原核表达载体,并对其产物进行变性、复性和纯化,检测其对肝癌细胞系的毒性作用。方法:以从人源天然Fab抗体库中筛选出的AM2-26克隆作为模板扩增出人源c-Met单链基因,采用基因... 目的:构建绿脓杆菌外毒素PE38KDEL融合全人源抗c-Met单链抗体原核表达载体,并对其产物进行变性、复性和纯化,检测其对肝癌细胞系的毒性作用。方法:以从人源天然Fab抗体库中筛选出的AM2-26克隆作为模板扩增出人源c-Met单链基因,采用基因工程原理,将扩增出的c-Met单链基因和PE38KDEL基因克隆入pBAD/GⅢA表达载体中,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确;转化大肠杆菌Top10F′,左旋阿拉伯糖诱导表达,采用镍离子螯合层析法纯化变性的包涵体样品,并用连续梯度透析的方法对纯化后的包涵体进行复性;采用流式细胞术鉴定复性产物与靶细胞的结合活性,MTT法检测c-Met/PE38KDEL免疫毒素对肝癌细胞的体外杀伤活性。结果:成功构建了免疫毒素表达载体pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL;诱导产物主要以包涵体形式存在;复性后的免疫毒素c-Met/PE38KDEL具有与靶细胞特异性结合的活性并且对SMMC7721细胞系具有较明显的杀伤作用。结论:全人源抗c-Met单链抗体与PE38KDEL重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果,为进一步肝癌的导向治疗提供依据。 展开更多

关键词 C-MET pe38 免疫毒素 肝细胞癌 表达 纯化

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抗肝癌单链抗体融合PE38重组免疫毒素的构建、表达及纯化 被引量：2

3

作者 赵强子 刘彦仿 +2 位作者 窦科峰 张静 李开宗 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第9期809-812,共4页

目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,并对其产物作初步纯化 ,检测其对人肝癌细胞系SMMC 772 1的毒性作用 .方法 :采用基因工程原理 ,将PE38基因片段亚克隆入hscFv表达载体 pGEX 4T 1中 ,重... 目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,并对其产物作初步纯化 ,检测其对人肝癌细胞系SMMC 772 1的毒性作用 .方法 :采用基因工程原理 ,将PE38基因片段亚克隆入hscFv表达载体 pGEX 4T 1中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ;转化大肠杆菌JM10 9后 ,受IPTG诱导表达GST融合蛋白 ,产物包涵体经变性、复性及重折叠并经GST亲合层析柱层析、凝血酶消化后 ,得到纯化的hscFv PE38融合蛋白 .采用MTT法检测hscFv PE38对SMMC772 1的杀伤作用 .结果 :实验成功构建了免疫毒素表达载体pGEX 4T 1 hscFv PE38(以下简称pGEXh PE38) ;诱导产物主要以包涵体形式存在 ,表达量为 11% ;纯化的hscFv PE38对SMMC 772 1细胞系具有较明显的杀伤作用 ,最大杀伤率为78% ,IC50 为 0 .386mg·L-1.结论 :人源化抗肝癌单链抗体与PE38重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果 。 展开更多

关键词 pe38 免疫毒素 癌 肝细胞 表达 纯化

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PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达 被引量：1

4

作者 赵强子 窦科峰 刘彦仿 《西北国防医学杂志》 CAS 2002年第6期421-423,共3页

目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,对其产物作初步鉴定 ,为肝癌的导向治疗奠定基础。方法 :采用分子克隆技术 ,PCR法扩增PE38基因片段 ,克隆入GST -融合蛋白表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv... 目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,对其产物作初步鉴定 ,为肝癌的导向治疗奠定基础。方法 :采用分子克隆技术 ,PCR法扩增PE38基因片段 ,克隆入GST -融合蛋白表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ,受IPTG诱导表达后 ,SDS -PAGE及Westernblot分析GST融合蛋白结果。结果 :成功构建免疫毒素表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv -PE38(以下简称pGEXh -PE38) ;SDS -PAGE清晰显示Mr为 90 0 0 0的目的蛋白条带 ,光密度薄层扫描提示表达量为 11% ,Westernblot在相同位置显示蛋白印迹 ,证实载体构建及表达均正确。结论 :利用基因重组技术 ,在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv -PE38。 展开更多

关键词 pe38 人源化抗肝癌单链抗体 重组免疫毒素 构建 肝细胞肝癌

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重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中的表达及其细胞毒性 被引量：1

5

作者 彭超 李岩松 +1 位作者 何晶龙 郭德军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第1期14-19,29,共7页

目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌... 目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5～1.0和1.0～1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。 展开更多

关键词 免疫毒素类 IL6(T22)-pe38 原核细胞 基因表达 细胞毒性

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hTERT启动子调控PE38KDEL基因载体的构建及其鉴定 被引量：1

6

作者 李宝玉 陈剑秋 《中国临床研究》 CAS 2010年第12期1073-1075,I0001,共4页

目的构建含有hTERT启动子和PE38KDEL基因片段的质粒phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP并对其鉴定。方法通过PCR方法扩增hTERTp,用其取代pIRES2-EGFP质粒的CMV启动子,全基因合成PE38KDEL基因片段,将其亚克隆到hTERTp-IRES2-EGFP的MCS中,经酶... 目的构建含有hTERT启动子和PE38KDEL基因片段的质粒phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP并对其鉴定。方法通过PCR方法扩增hTERTp,用其取代pIRES2-EGFP质粒的CMV启动子,全基因合成PE38KDEL基因片段,将其亚克隆到hTERTp-IRES2-EGFP的MCS中,经酶切及测序鉴定。结果经鉴定,成功将hTERTp及PE38KDEL两个基因片段插入亚克隆到pIRES2-EGFP中。结论成功构建phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP真核表达载体,有望使PE38KDEL阳性的胰腺癌细胞中特异性表达,起到杀伤胰腺癌细胞的作用,为肿瘤的靶向基因治疗提供了一条新思路。 展开更多

关键词 HTERT启动子 pe38KDEL基因 载体构建 鉴定

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靶向phTERT-PE38KDEL重组质粒联合硼替佐米抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长的研究

7

作者 邢帅 孙晋津 +2 位作者 李宝玉 孙宁 陈剑秋 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2011年第19期3495-3497,共3页

目的:探讨重组质粒phTERT-PE38KDEL联合硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的作用。方法:采用人胰腺癌MiaPaCa2细胞系建立荷瘤裸鼠模型,通过腹腔给药和瘤内注射方式,以硼替佐米联合phTERT-PE38KDEL对荷瘤鼠进行治疗,比较各组肿瘤体积和质量... 目的:探讨重组质粒phTERT-PE38KDEL联合硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的作用。方法:采用人胰腺癌MiaPaCa2细胞系建立荷瘤裸鼠模型,通过腹腔给药和瘤内注射方式,以硼替佐米联合phTERT-PE38KDEL对荷瘤鼠进行治疗,比较各组肿瘤体积和质量,计算抑瘤率。免疫组化法检测核增殖抗原及微血管密度,TUNEL染色检测肿瘤的凋亡。结果:联合治疗组(A组)的肿瘤体积及瘤重在每个检测点均小于基因治疗组(B组)、单纯化疗组(C组)和空白对照组(D组)(P<0.01),与D组相比,A、B、C组肿瘤抑制率分别为:68.98%、51.44%、16.39%。与B和C组相比较,A组的瘤体PCNA增殖指数与MVD显著降低(P<0.01),A组的细胞凋亡数显著增多(P<0.01)。结论:phTERT-PE38KDEL与硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤均有抑制作用,二者联用效果更佳。 展开更多

关键词 胰腺肿瘤 HTERT启动子 pe38KDEL基因 硼替佐米

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hTERT启动子调控下PE38KDEL表达载体的构建及其在MiaPaCa_2人胰腺癌细胞中的表达

8

作者 李宝玉 陈剑秋 孙晋津 《山东医药》 CAS 北大核心 2011年第1期1-3,共3页

目的探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达。方法通过PCR法扩增hTERT启动子,全基因合成PE38KDEL,将其分别亚克隆到pIRES2-EGFP及phTERTp-IRES2-EGF... 目的探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达。方法通过PCR法扩增hTERT启动子,全基因合成PE38KDEL,将其分别亚克隆到pIRES2-EGFP及phTERTp-IRES2-EGFP质粒的多克隆位点中;均经酶切及测序鉴定。通过脂质体法将两质粒分别转染MiaPaCa2及WI-38细胞,观察荧光表达情况,通过RT-PCR检测PE38KDEL的表达。结果经酶切及测序鉴定证实质粒构建成功,pPE38KDEL-IRES2-EGFP转染后MiaPaCa2和WI-38细胞中均有PE38KDEL基因表达;但phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP转染后仅MiaPaCa2中有PE38KDEL基因表达。结论 hTERT调控下PE38KDEL表达载体构建成功,并可在MiaPaCa人胰腺癌细胞中靶向性表达,为探讨胰腺癌的靶向基因治疗提供了实验依据。 展开更多

关键词 HTERT启动子 pe38KDEL 胰腺肿瘤 基因疗法

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重组免疫毒素IL3-PE38KDEL真核表达载体的构建

9

作者 白凤霞 娄世峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期106-108,共3页

目的:构建大肠杆菌-毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶... 目的:构建大肠杆菌-毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体Ppic9k-IL3-Lin-ker-PE38KDEL构建成功。结论:成功地构建融合基因IL3-PE38KDEL的毕赤酵母表达载体,为后续的蛋白质的表达、纯化及功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 融合基因 IL3 pe38KDEL 真核表达载体 PPIC9K

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IL-18-PE38真核表达质粒的构建及表达

10

作者 代吕霞 李虹 +1 位作者 陈登榜 曾俊 《成都医学院学报》 CAS 2007年第Z1期170-173,共4页

目的构建含有白细胞介素18(Interleukin18,IL-18)及毒素融合基因的真核表达质粒,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38(Pseudomonas exotoxin A)融合基因插入真核表达载体Psec Tag2B中,构建真核表达质... 目的构建含有白细胞介素18(Interleukin18,IL-18)及毒素融合基因的真核表达质粒,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38(Pseudomonas exotoxin A)融合基因插入真核表达载体Psec Tag2B中,构建真核表达质粒Psec Tag2B-IL-18-PE38,重组质粒经限制性内切酶及PCR测定证实构建成功后,用脂质体介导法将其转染小鼠NIH3T3细胞中,然后用免疫荧光技术鉴定其表达。结果经酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因已被正确地插入真核表达载体Psec Tag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在其中表达。结论成功构建了重组的真核表达载体Psec Tag2B-IL-18-PE38并在体外细胞株获得表达,为下一步动物实验打下基础。 展开更多

关键词 IL-18-pe38融合基因 真核表达 脂质体 免疫荧光

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免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴细胞白血病实验研究

11

作者 刘晓蕾 高磊 崔娜 《中国现代医学杂志》 CAS 北大核心 2016年第20期6-11,共6页

目的探讨免疫毒素CCL25-PE38对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系MOLT4(天然高水平表达CCR9)的杀伤作用,以期为T-ALL的靶向治疗提供基础。方法通过流式细胞术、共聚焦显微术检测CCL25-PE38与MOLT4细胞的结合及内化,Transwell趋化小室检... 目的探讨免疫毒素CCL25-PE38对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系MOLT4(天然高水平表达CCR9)的杀伤作用,以期为T-ALL的靶向治疗提供基础。方法通过流式细胞术、共聚焦显微术检测CCL25-PE38与MOLT4细胞的结合及内化,Transwell趋化小室检测其趋化能力,细胞增殖试剂WST-1检测其细胞杀伤能力,Annexin V-FITC/PI染色检测其凋亡诱导效应,建立SCID小鼠白血病细胞异种移植肿瘤(CCR9+肿瘤)模型检测CCL25-PE38的抑瘤效果。结果 WST-1检测结果显示CCL25-PE38能特异性杀伤MOLT4细胞;Annexin V-FITC/PI染色显示CCL25-PE38主要通过凋亡诱导效应引起MOLT4细胞死亡;在SCID小鼠白血病细胞异种移植瘤模型中,注入CCL25-PE38能缓解CCR9+肿瘤的生长。结论CCL25-PE38通过凋亡诱导作用引起MOLT4细胞死亡,缓解异种移植CCR9+肿瘤的生长。 展开更多

关键词 CCL25-pe38 急性T淋巴细胞白血病 免疫毒素

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免疫毒素IL-18-PE38原核表达载体的构建及其鉴定(英文)

12

作者 李虹 李明远 +2 位作者 吕梅励 蒋忠华 张林 《航天医学与医学工程》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期395-398,共4页

目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体,并鉴定其产物在大肠杆菌中的表达。方法首先经逆转录2聚合酶链反应(RT-PCR)获得小鼠IL-18基因,再通过酶切及连接反应,构建小鼠IL218与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL18-PE... 目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体,并鉴定其产物在大肠杆菌中的表达。方法首先经逆转录2聚合酶链反应(RT-PCR)获得小鼠IL-18基因,再通过酶切及连接反应,构建小鼠IL218与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL18-PE38,重组载体经PCR、限制性内切酶及DNA序列测定证实连接片段正确后,转染感受态大肠杆菌BL-1,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果成功构建了IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-18的特异性抗体所识别。结论获得了IL-18-PE38融合基因在原核系统的表达,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。 展开更多

关键词 IL-18-pe38 重组免疫毒素 原核表达 基因构建

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靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定 被引量：3

13

作者 毛春燕 安钢力 +4 位作者 王祥岭 翟晓晨 孟会敏 游凤涛 杨林(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期558-562,573,共6页

目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原... 目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体p ET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot验证。通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR阳性细胞A549、HT29、MCF-7和EGFR阴性细胞CEM、Jurkat的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1试剂检测BI7D12-PE38KDEL对上述细胞的杀伤效果。结果:通过SDS-PAGE和Western blot实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达。BI7D12-PE38KDEL能够与EGFR阳性的A549、HT29、MCF-7肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM和Jurkat相比具有极其显著性差异(P<0.01)。结论:成功地构建了基于EGFR纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞。 展开更多

关键词 表皮生长因子受体 纳米抗体7D12 免疫毒素 铜绿假单胞菌外毒素pe38KDEL

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IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达 被引量：3

14

作者 吴瑕 张林 +3 位作者 屈艺 李明远 蒋中华 李虹 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期456-459,共4页

目的构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体,并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中,构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38,经EcoR单酶切及PCR... 目的构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体,并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中,构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38,经EcoR单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞,通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果经EcoR单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达,为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 IL-18-pe38融合基因 真核表达载体 软骨细胞 脂质体

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大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达 被引量：1

15

作者 孙岚 祁志荣 +5 位作者 张琴 林媛 李明远 张林 蒋忠华 李虹 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期482-485,共4页

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDE... 目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL。重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH3T3细胞的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH3T3细胞表达。结论rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础。 展开更多

关键词 rIP-10 pe38KDEL 重组免疫毒素 NIH 313细胞 真核表达

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铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定 被引量：1

16

作者 张琴 李明远 +3 位作者 张林 蒋忠华 祁志荣 李虹 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期291-294,共4页

目的构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、... 目的构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性。结果经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别。结论PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌外毒素 pe38KDEL 原核表达

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抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测 被引量：2

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作者 纪洪帅 郭锦瑞 +1 位作者 杨颖 毛伟平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期354-361,366,共9页

目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表... 目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot鉴定;间接ELISA和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。 展开更多

关键词 B7-H4 单链抗体 绿脓杆菌外毒素pe38KDEL 重组免疫毒素 靶向治疗

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利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

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作者 管蕊 唐旭东 +2 位作者 徐莉 朱峰 沈中元 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期507-511,共5页

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-P... 利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 家蚕 pe38蛋白 丝氨酸蛋白酶 过氧化氢酶 酵母双杂交系统

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家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

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作者 于洁 陈红丽 +3 位作者 张志林 徐莉 沈中元 唐旭东 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期428-435,共8页

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SR... 家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 极早期蛋白pe38 家蚕SRSF蛋白激酶(Bm SRPK) 相互作用 酵母双杂交 荧光双分子互补 实时荧光定量PCR

原文传递

IL3-PE38KDEL融合基因的构建及原核表达

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作者 陈妤 娄世锋 邓建川 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1028-1031,共4页

目的:构建原核表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL,并诱导和鉴定其蛋白表达。方法:用PCR方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体PQE30-Linker中得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体... 目的:构建原核表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL,并诱导和鉴定其蛋白表达。方法:用PCR方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体PQE30-Linker中得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确,转化感受态大肠杆菌SG13009,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分子量大小,Western blot鉴定。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL构建成功,IPTG诱导后得到了与预计分子量相符的目的蛋白。经Western blot鉴定在分子量57kD处有明显特异性条带,说明目的蛋白正确表达。结论:成功构建融合蛋白IL3-PE38KDEL,为后续的蛋白质纯化及功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 融合基因 白介素3 pe38KDEL 原核表达 PQE30

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