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慢病毒介导的PDE12稳定敲低和过表达胃癌细胞模型的构建及其细胞定位分析
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作者 刘乙锦 许文扬 +3 位作者 魏锦骥 宋欢喜 李佳慧 张丽娜 《生物技术进展》 2025年第2期355-363,共9页
磷酸二酯酶12(phosphodiesterase 12,PDE12)是核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶(endonuclease/exonuclease/phosphatase,EEP)超家族成员之一。为进一步研究PDE12基因在细胞中的功能,拟使用慢病毒感染技术在胃癌细胞中稳定敲低和过表达PDE1... 磷酸二酯酶12(phosphodiesterase 12,PDE12)是核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶(endonuclease/exonuclease/phosphatase,EEP)超家族成员之一。为进一步研究PDE12基因在细胞中的功能,拟使用慢病毒感染技术在胃癌细胞中稳定敲低和过表达PDE12基因并获得相应的稳转细胞模型。首先将靶向敲低PDE12基因的shRNA序列插入慢病毒干扰载体pLVX-shRNA2-Puro,PDE12基因全长cDNA插入慢病毒过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro,经测序鉴定正确后包装慢病毒并感染人胃癌细胞MKN-45和BGC-823,然后用嘌呤霉素筛选出稳转细胞系,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blot检测PDE12在稳转胃癌细胞系中mRNA和蛋白水平的敲低和过表达效率。此外,还构建了pEGFP-PDE12真核表达载体,转染人胃癌细胞MKN-45和BGC-823,通过免疫荧光实验分析PDE12在胃癌细胞中的定位。结果显示,MKN-45-shPDE12和BGC-823-shPDE12稳转细胞中PDE12的表达量显著降低,MKN-45-PDE12和BGC-823-PDE12稳转细胞中PDE12的表达量显著升高,提示利用慢病毒感染技术成功构建了稳定敲低和过表达PDE12的胃癌细胞系。激光共聚焦显微镜观察显示表达PDE12的绿色荧光在核质中均有分布,进一步通过线粒体MitoTracker Red染色发现PDE12表达的绿色荧光与线粒体MitoTracker Red红色荧光存在共定位,说明PDE12定位在胃癌细胞的线粒体中。这些研究结果可为后续深入研究PDE12在胃癌的功能及作用机制提供了基础。 展开更多
关键词 pde12 慢病毒 胃癌 细胞定位
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