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PDCoV N蛋白原核表达与多克隆抗体的制备
1
作者 李明玉 姜宇航 +6 位作者 张国庆 邓玲聪 李乐天 郝嘉翼 张雪 李佳妮 李昌 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第8期1587-1592,1608,共7页
将猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白基因优化后连接至pET-30a载体上,获得pET-30a-N质粒,热激法将其转入3株BL21大肠杆菌进行表达,探究蛋白表达的条件,并应用Ni Focurose 6FF(IMAC)纯化蛋白。以纯化后蛋白作为抗原免疫新西兰白兔,获得了PDCoV N... 将猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白基因优化后连接至pET-30a载体上,获得pET-30a-N质粒,热激法将其转入3株BL21大肠杆菌进行表达,探究蛋白表达的条件,并应用Ni Focurose 6FF(IMAC)纯化蛋白。以纯化后蛋白作为抗原免疫新西兰白兔,获得了PDCoV N蛋白多抗,并利用间接ELISA方法鉴定抗体效价及Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)鉴定抗体的特异性。结果显示,pET-30a-N质粒在BL21 StarTM(DE3)中表达水平较高,且最佳表达条件为37℃4 h;纯化后目的蛋白纯度可达90.3%,间接ELISA结果显示抗体效价可达1∶204800;IFA和Western blot检测表明制备出的兔多克隆抗体具有良好特异性,并可特异性检测PDCoV的感染。结果表明,本试验制备出特异性识别PDCoV N蛋白的多克隆抗体,为后续探究PDCoV N蛋白的功能提供了一些参考,为建立PDCoV诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 pdcov N蛋白 原核表达 多克隆抗体
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PEDV、PoRV、PDCoV多重荧光定量RT-PCR方法的建立和应用 被引量：1
2
作者 陈登金 李鹏宇 +5 位作者 董楠 常昊天 胡渤 肖进 张蕾 马良 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第9期71-78,共8页
为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的同时鉴别检测,本试验根据PEDV核衣壳蛋白(N)基因、PoRV结构蛋白6(VP6)基因和PDCoV基质蛋白(M)基因筛选设计3对特异性引物和荧光标记探针,通过矩阵法优化... 为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的同时鉴别检测,本试验根据PEDV核衣壳蛋白(N)基因、PoRV结构蛋白6(VP6)基因和PDCoV基质蛋白(M)基因筛选设计3对特异性引物和荧光标记探针,通过矩阵法优化反应条件,建立多重荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,绘制标准曲线,验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并进行临床样本检测。标准曲线拟合试验结果显示,PEDV、PoRV和PDCoV多重荧光定量RT-PCR方法针对各病毒扩增均具有良好的相关系数和扩增效率;特异性试验结果显示,该方法仅对PEDV、PoRV和PDCoV呈现特异性扩增,不与其他猪源病毒发生交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对PEDV、PoRV和PDCoV的最低检测限均为1×10^(0)copies/μL;组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对367份临床样本进行PEDV、PoRV和PDCoV检测,多重荧光定量RT-PCR检测的阳性率为92.37%(339/367),而地方标准多重RT-PCR检测的阳性率为83.38%(306/367),2种方法临床样本检测符合率为91.01%(334/367)。结果表明,本试验建立了一种可快速、准确、灵敏检测PEDV、PoRV和PDCoV的多重荧光定量RT-PCR方法,可用于实验室病原和临床样本检测,为临床猪病毒性腹泻的研究和防控提供了有效技术方法。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪轮状病毒(PoRV) 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) 逆转录聚合酶链式反应
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稳定表达PDCoV-S和RBD蛋白的293T细胞系构建与免疫原性评价 被引量：1
3
作者 肖丽 赵淑庆 +6 位作者 袁雪松 范丽原 易鑫 陈琢琦 李彬 李基棕 主性 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期959-965,共7页
为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中... 为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中进行慢病毒包装,收集上清感染293T细胞,经嘌呤霉素初筛得到的多细胞克隆,进一步通过终点稀释法筛选获得稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的单克隆293T细胞系,通过Western blot检测蛋白表达,用纯化的PDCoV S和RBD蛋白分别免疫BALB/c小鼠,对重组蛋白进行免疫原性检测。结果表明,稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的293T细胞系构建成功,获得了重组慢病毒,纯化PDCoV S和RBD重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高的IgG抗体(S:1.2;RBD:0.9),中和抗体水平分别达1∶128和1∶64。本研究构建的293T细胞系能稳定表达PDCoV S和RBD蛋白,为进一步研制PDCoV亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 293T细胞系 pdcov 慢病毒 稳定表达
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猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用 被引量：2
4
作者 余姓鸿 张婧 +7 位作者 安微 杨苗 谢礼 舒佳新 薛昌华 郑巧 林华 韩国全 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2024年第2期210-219,共10页
人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhe... 人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。 展开更多
关键词 猪肉 戊型肝炎病毒(HEV) 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪δ冠状病毒(pdcov) 三重qPCR
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PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定
5
作者 刘青 顾天越 +9 位作者 包利霞 朱凡杰 王鑫源 刘婷婷 朱晓琛 鄢明华 董志民 王利丽 张东超 金天明 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3495-3505,共11页
[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T... [目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) S蛋白 表位疫苗
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规模猪场哺乳仔猪混合感染PEDV和PDCoV暴发腹泻的综合防控 被引量：7
6
作者 陈志雄 王洪海 张峰 《中国猪业》 2019年第5期85-88,共4页
报道了一例规模化猪场哺乳仔猪混合感染PEDV和PDCoV后发生腹泻的病例。通过流行病学、病理变化以及实验室PCR/RT-PCR检测结果予以确诊,并及时采取紧急免疫,停用霉变饲料原料,添加保肝解毒、提高机体免疫功能的药物等综合防控措施,控制... 报道了一例规模化猪场哺乳仔猪混合感染PEDV和PDCoV后发生腹泻的病例。通过流行病学、病理变化以及实验室PCR/RT-PCR检测结果予以确诊,并及时采取紧急免疫,停用霉变饲料原料,添加保肝解毒、提高机体免疫功能的药物等综合防控措施,控制了该猪场腹泻病情的扩散。 展开更多
关键词 仔猪 腹泻 PEDV pdcov 霉菌毒素
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PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：6
7
作者 王征帆 朱利塞 +6 位作者 王娟 李祎云 向蕊 应碧云 王贵平 贾爱卿 白挨泉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第10期3855-3863,共9页
试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验... 试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R2(P)=0.9994和R2(T)=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数(CV)均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%(6/114)和8.8%(10/114),混合感染检出率为4.6%(5/114),比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) 传染性胃肠炎病毒(TGEV) TAQMAN探针 双重实时荧光定量PCR
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同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用 被引量：27
8
作者 任玉鹏 张斌 +2 位作者 汤承 曹恭貌 岳华 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期756-762,共7页
为建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCo V)的多重RT-PCR方法,根据Gen Bank中PEDV和TGEV基因序列保守区设计2对引物,参照文献合成1对PDCo V引物,优化三对引物在同一RT-PCR扩增体系... 为建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCo V)的多重RT-PCR方法,根据Gen Bank中PEDV和TGEV基因序列保守区设计2对引物,参照文献合成1对PDCo V引物,优化三对引物在同一RT-PCR扩增体系下的浓度、退火温度等反应条件,同时优化方法的灵敏度、特异性。将初步建立的多重RT-PCR方法用于检测采自四川省及重庆市14个猪场的222份样品。结果表明,本试验建立的多重RT-PCR在引物量分别为PEDV 0.2 L,PDCo V 0.2 L和TGEV 0.4L,退火温度为53℃时的扩增效果最佳;最低检测量分别为PEDV:60.96 pg、PDCo V:58.85 pg、TGEV:102.69 pg;用该法对多种猪传染病病原DNA或c DNA进行扩增时均无非特异性扩增条带出现。对222份腹泻样品的检测结果表明,PEDV阳性检出率为52.2%,PDCo V为2.7%,TGEV为2.3%。同时多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR检测方法符合率分别为PEDV 92.9%、PDCo V 100%、TGEV 100%。表明该法具较高可信度。本试验建立了一种高效、特异地同时检测PEDV、TGEV和PDCo V的多重RT-PCR方法,为病原的实验室诊断和分子流行病学调查提供了技术支持。对四川省及重庆市部分猪场三种病原流行情况进行调查和统计分析,为地区猪腹泻病的防控提供了依据。 展开更多
关键词 多重RT-PCR 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪Delta冠状病毒 检测
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PDCoV、PKV和MRV三重荧光定量PCR方法的建立及初步应用 被引量：2
9
作者 王利丽 李富强 +6 位作者 董明奇 任卫科 路超 张莉 江珊 田向学 鄢明华 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期823-830,共8页
为了快速同步检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)和猪呼肠孤病毒(MRV),参考GenBank中PDCoV M、PKV 5’UTR和MRV L1基因保守序列,设计了特异性引物和探针并优化了反应条件,建立了同时检测PDCoV、PKV和MRV的三重荧光定量PCR方法... 为了快速同步检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)和猪呼肠孤病毒(MRV),参考GenBank中PDCoV M、PKV 5’UTR和MRV L1基因保守序列,设计了特异性引物和探针并优化了反应条件,建立了同时检测PDCoV、PKV和MRV的三重荧光定量PCR方法。该方法可特异性检出PDCoV、PKV和MRV,与PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、PEDV、TGEV、RV等病原无交叉反应,3种病毒的最低检测量分别为2.7×10^(1)copies/μL、1.22×10^(1)copies/μL和1.26×10^(2)copies/μL,组内及组间变异系数为0.001~0.019。应用所建立的方法与行业标准及文献报道方法同时检测142份临床样本,结果显示与行业标准及文献报道方法阳性符合率为78%~94.92%。本研究建立的三重荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,为临床PDCoV、PKV和MRV的鉴别诊断和流行病学调查提供了快速敏感的技术手段。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 猪嵴病毒 猪呼肠孤病毒 三重荧光定量PCR方法 同步检测
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氨基肽酶N(APN)促进猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)侵入细胞的分子机制 被引量：8
10
作者 YANG YUE-LIN LIU JIAN-BO WANG TONG-YUN 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1025-1025,共1页
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新型猪肠道冠状病毒,是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科、δ冠状病毒属成员,为有囊膜的单股正链RNA病毒。2012年首次在香港发现该病毒,可致哺乳仔猪腹泻和呕吐,迅速脱水,严重时会致猪死亡。
关键词 德尔塔 细胞系 冠状病毒 pdcov APN 氨基肽酶 分子机制
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PDCoV、PEAV、TGEV及PEDV“一步法”多重荧光RT-PCR的建立和应用 被引量：2
11
作者 赵冉 蔡振鸿 +8 位作者 彭小莉 陈琼 李传勇 孔繁德 许秋贝 宋娜杰 陈雅婷 石文志 刘文媛 《中国动物检疫》 CAS 2023年第7期88-94,共7页
为快速鉴别检测猪冠状病毒,使用一步法试剂,对猪δ冠状病毒、猪肠道α冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪流行性腹泻病毒的检测方法进行优化,建立了同时检测上述4种病毒的“一步法”多重荧光RTPCR。随后对该方法的特异性、敏感性、重... 为快速鉴别检测猪冠状病毒,使用一步法试剂,对猪δ冠状病毒、猪肠道α冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪流行性腹泻病毒的检测方法进行优化,建立了同时检测上述4种病毒的“一步法”多重荧光RTPCR。随后对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评估,并将其用于厦门市规模猪场上述4种腹泻病毒感染的流行病学调查。结果显示:该方法的敏感性高,对上述4种病毒阳性质粒的最低检出限均可达101copies/μL;特异性好,对4种病毒的单一及混合模板进行检测时,均可在相应荧光通道中获得良好的扩增曲线,而对其他病毒和细菌无扩增信号;重复性好,批间试验变异系数小于1.1%。使用该方法对从厦门市53家猪场采集的265份腹泻样品进行检测,4 h即可完成全部检测,猪δ冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的场阳性率分别为18.87%和5.66%,未检出猪肠道α冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒。结果表明,本研究建立的方法敏感性高,特异性及重复性好,操作简便、耗时短,适用于临床大批量样本的检测,可为防控猪腹泻疾病提供有力的技术支持。 展开更多
关键词 多重荧光RT-PCR pdcov PEDV TGEV PEAV
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猪三角洲病毒(PDCoV)研究现状 被引量：1
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作者 龚商羽 《新农业》 2020年第5期67-68,共2页
近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪三角洲病毒(PDCoV)在多个国家相继暴发,给养猪业造成了巨大的经济损失,目前仍然是一个严峻的挑战。猪三角洲病毒(PDCoV)隶属于冠状病毒科三角花叶病毒属,它是一种新兴的猪肠道病毒,在哺乳仔猪中引起... 近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪三角洲病毒(PDCoV)在多个国家相继暴发,给养猪业造成了巨大的经济损失,目前仍然是一个严峻的挑战。猪三角洲病毒(PDCoV)隶属于冠状病毒科三角花叶病毒属,它是一种新兴的猪肠道病毒,在哺乳仔猪中引起腹泻、呕吐、脱水和死亡,死亡率为40%~80%。本文从三角洲病毒的病原学、传染源、传播途径、致病性和检测技术等方面进行阐述,以便为制定有效的防控措施提供依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪三角洲病毒(pdcov) 检测技术
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PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：8
13
作者 陈见兴 王豪杰 +8 位作者 潘喻 刘弘毅 林欢 朱良全 陈洪岩 谢金鑫 夏长友 张贺 王玉娥 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期5439-5448,共10页
【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染... 【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域序列设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量;以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内试验验证其重复性;经检测临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】建立的三重RT-PCR检测方法最佳退火温度为58.3℃,引物最佳浓度分别为0.50、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内试验检测结果均一致。最后经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为4.4%、0%和0.73%,与已报道的检测方法一致。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 新型猪急性腹泻综合征冠状病毒 塞内卡病毒A型 三重RT-PCR
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STAG2基因敲除的IPEC-J2细胞系构建及其对PDCoV复制影响的研究 被引量：1
14
作者 张洪玲 陈建飞 +4 位作者 石照蓉 李明蔚 吴洋 郭龙军 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期550-554,共5页
为探究猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中基质抗原2(STAG2)因子对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)复制的影响,本研究针对STAG2基因设计并合成sgRNA,将其克隆至lentiCRISPR v2载体构建重组表达质粒。将重组质粒转染至IPEC-J2细胞后,利用嘌呤霉素(Puromy... 为探究猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中基质抗原2(STAG2)因子对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)复制的影响,本研究针对STAG2基因设计并合成sgRNA,将其克隆至lentiCRISPR v2载体构建重组表达质粒。将重组质粒转染至IPEC-J2细胞后,利用嘌呤霉素(Puromycin)采用有限稀释法进行亚克隆,筛选STAG2基因缺失的单克隆细胞株,并经western blot鉴定后最终获得一株STAG2缺失的单克隆稳定细胞系IPEC-J2-STAG2-/-(KO)。利用western blot方法鉴定不同代次STAG2敲除细胞的遗传稳定性,结果显示,IPEC-J2-STAG2-/-细胞具有良好的遗传稳定性。为探究STAG2基因对PDCoV复制的影响,本研究将PDCoV分别感染IPEC-J2-STAG2-/-细胞和野生型IPECJ2细胞(WT),采用荧光定量PCR、western blot方法检测细胞中PDCo V N基因m RNA转录及其蛋白表达水平。结果显示,与WT组相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞中PDCo V N基因m RNA转录水平及其蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01),表明STAG2缺失会抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制。为探究STAG2缺失是否刺激宿主细胞产生天然免疫应答,本研究利用荧光定量PCR方法检测敲除细胞中3种天然免疫应答相关干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平,结果显示,与WT相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞内相关ISGs转录水平显著升高(P<0.01),表明STAG2缺失后宿主细胞启动天然免疫应答进而抑制PDCoV的复制。本研究首次发现STAG2基因缺失后显著上调了IPEC-J2细胞天然免疫抗病毒基因的转录水平,从而抑制PDCoV的复制,为研究PDCoV和宿主因子相互作用提供了新思路。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 基质抗原2 CRISPR/Cas9 敲除细胞系
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凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测 被引量：2
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作者 彭艳伶 李昊 +4 位作者 余琼 李建 张斌 沈思思 任玉鹏 《四川畜牧兽医》 2017年第7期18-20,22,共4页
为了解四川省凉山州部分猪场3种猪腹泻病毒的感染情况,本研究采用RT-PCR方法,分别对来自德昌、冕宁县和宁南县多个规模化猪场的60份猪腹泻样本进行病原检测,包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪A群轮状病毒(GARV)... 为了解四川省凉山州部分猪场3种猪腹泻病毒的感染情况,本研究采用RT-PCR方法,分别对来自德昌、冕宁县和宁南县多个规模化猪场的60份猪腹泻样本进行病原检测,包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪A群轮状病毒(GARV)。结果显示:3种病原的检出率分别为PEDV15%、PDCoV33.33%、GARV58.33%,其中冕宁县PDCoV检出率为65%,而GARV检出率更高达70%;3种病毒混合感染的情况普遍存在,总体混合感染率分别为:德昌15%(3/20),冕宁60%(12/20),宁南5%(1/20),混合感染类型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的协同致病性。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪Delta冠状病毒 猪A群轮状病毒 RT—PCR
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PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 陈见兴 王豪杰 +8 位作者 潘喻 刘弘毅 林欢 朱良全 陈洪岩 谢金鑫 夏长友 张贺 王玉娥 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期5100-5111,共12页
【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染... 【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 新型猪急性腹泻综合征冠状病毒 塞内卡病毒A型 三重RT-PCR
原文传递
PDCoV N基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 马翮斯 罗灵芝 +2 位作者 王元红 虞凌雪 李国新 《中国猪业》 2025年第5期65-72,共8页
猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种对哺乳仔猪致病性较强的病原体,感染后可导致急性水样腹泻、呕吐以及高死亡率(30%-50%),对全球养猪业危害严重。为建立一种灵敏且准确的PDCoV检测方法,本研究基于PDCoV N基因的... 猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种对哺乳仔猪致病性较强的病原体,感染后可导致急性水样腹泻、呕吐以及高死亡率(30%-50%),对全球养猪业危害严重。为建立一种灵敏且准确的PDCoV检测方法,本研究基于PDCoV N基因的保守序列设计特异性引物和探针,优化反应体系,成功构建了一种TaqMan荧光定量PCR(qPCR)检测方法。以PDCoV N基因重组质粒作为标准品,该方法在8.79×10^(1)-8.79×10^(8) copies/μL范围内线性关系良好(R^(2)=0.997,斜率=-3.236),最佳引物和探针浓度分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L。结果显示,该方法敏感性高,最低检测限为8.79 copies/μL;特异性强,与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)均无交叉反应;重复性好,组间变异系数和组内变异系数均小于1.5%。本研究建立的qPCR方法可为PDCoV的临床检测和流行病学调查提供可靠的技术支撑。 展开更多
关键词 猪 猪德尔塔冠状病毒 核衣壳基因 TaqMan qPCR 仔猪腹泻
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猪德尔塔冠状病毒截短S1蛋白原核表达与多克隆抗体制备
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作者 叶曼青 叶晨倩 +10 位作者 秦文珍 杨心雨 翟雪滢 郑浩 童武 李国新 于海 童光志 孔宁 李智丽 单同领 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期132-138,共7页
自2014年猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)在美国暴发以来,严重危害生猪健康,给各国的经济带来重大压力。本试验拟将PDCoV S1蛋白截短,通过原核表达获得重组蛋白,并且制备对应的多克隆抗体。利用生物信息学软件对PDCoV S1蛋白的亲疏水性进行分析... 自2014年猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)在美国暴发以来,严重危害生猪健康,给各国的经济带来重大压力。本试验拟将PDCoV S1蛋白截短,通过原核表达获得重组蛋白,并且制备对应的多克隆抗体。利用生物信息学软件对PDCoV S1蛋白的亲疏水性进行分析,将其截短为3个相互重叠的基因片段,并通过原核表达获得重组蛋白。以重组蛋白为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示:截短获得的3个重组蛋白均在包涵体中稳定表达,通过间接ELISA、Western blot和IFA检测方法,表明制备的多克隆抗体具有良好的抗体效价和特异性识别能力。本研究制备出特异性识别PDCoV S蛋白的多克隆抗体,为后续研究PDCoV S蛋白的结构和功能提供了工具,为建立PDCoV诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 pdcov S蛋白 截短蛋白 原核表达 多克隆抗体
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转录因子CEBPB对猪δ冠状病毒体外复制的抑制作用
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作者 陈琢琦 范丽原 +4 位作者 钟纯燕 于岩飞 李基棕 李彬 袁晓民 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3423-3432,共10页
本研究旨在探索CCAAT增强子结合蛋白β(CEBPB)对猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)复制的影响。将PDCoV接种于LLC-PK1细胞,检测不同时间点CEBPB表达水平变化;过表达和敲低CEBPB,利用qPCR和Western blot评估其对PDCoV复制的... 本研究旨在探索CCAAT增强子结合蛋白β(CEBPB)对猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)复制的影响。将PDCoV接种于LLC-PK1细胞,检测不同时间点CEBPB表达水平变化;过表达和敲低CEBPB,利用qPCR和Western blot评估其对PDCoV复制的影响;并进一步明确CEBPB在PDCoV复制周期中的作用;利用qPCR筛选出影响CEBPB上调的病毒蛋白,共聚焦显微镜观察PDCoV病毒蛋白与CEBPB的共定位现象。结果显示,随着病毒感染时间的延长,细胞中CEBPB的表达量呈上升趋势,过表达CEBPB显著抑制了PDCoV的复制,而敲低CEBPB则促进病毒的复制,CEBPB主要作用于PDCoV的复制阶段,并且PDCoV Nsp4能促进CEBPB表达,共聚焦显微镜观察发现两者存在共定位。综上表明,CEBPB能显著抑制PDCoV复制,为基于CEBPB研制潜在的抗病毒药物提供了新的思路。 展开更多
关键词 CEBPB pdcov NSP4 抗病毒
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猪德尔塔冠状病毒感染与抗感染研究进展 被引量：1
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作者 毛福超 翟崇凯 +4 位作者 田文静 王聪慧 宋敏杰 王迎鲜 张贺伟 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1281-1291,共11页
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型肠道冠状病毒,主要感染哺乳仔猪,临床表现为腹泻、呕吐、脱水等症状,发病率可达100%。PDCoV严重危害新生仔猪健康,现已成为引起猪群腹泻的主要病原体之一。PDCoV通过膜融合... 猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型肠道冠状病毒,主要感染哺乳仔猪,临床表现为腹泻、呕吐、脱水等症状,发病率可达100%。PDCoV严重危害新生仔猪健康,现已成为引起猪群腹泻的主要病原体之一。PDCoV通过膜融合及受体介导的内吞作用侵入宿主细胞,S蛋白是病毒侵入细胞的主要结构,表面氨基肽酶N、小窝蛋白是病毒侵入细胞的关键位点。此外,表面氨基肽酶N目前被认为是PDCoV跨物种传播的重要位点。细胞通过干扰素(IFN)基因表达、胆固醇代谢及N蛋白泛素化等途径引发抗感染。PDCoV通过自身结构蛋白、辅助蛋白及非结构蛋白等通过干扰IFN的表达及诱导侵染细胞凋亡等途径产生免疫逃避,进而持续侵染宿主细胞。目前用于预防和控制PDCoV感染的商业疫苗或抗病毒药物多在试验研发阶段或初上市阶段,其对PDCoV的预防和控制的临床效果亟需市场验证。尤其是针对病毒复制、免疫逃逸、抗PDCoV宿主因子等靶点开发的抗病毒药物或疫苗,为未来开发新型疫苗或抗病毒药物研发提供了新的研究方向和坚实的基础。笔者通过阐述PDCoV与宿主之间的感染和抗感染机制,探究多种抗病毒药物抑制PDCoV感染的潜在作用机制,为研究PDCoV致病机制、抗PDCoV感染治疗以及新药物的开发提供参考。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) 致病性 免疫逃逸 抗病毒机制
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