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PCV2ORF1、ORF2截短基因原核表达载体的构建及表达 被引量:2
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作者 时建立 李俊 +4 位作者 丁鹏 吴家强 孙文博 丛晓燕 周顺 《家畜生态学报》 2010年第3期24-26,共3页
采用PCR方法,从PCV2双拷贝DNA感染性克隆中扩增出PCV2 ORF1和ORF2截短基因,与pQE30原核表达载体分别经KpnI和HandIII双酶切,连接,经鉴定后证明成功构建pQE30-ORF1、pQE30-ORF2原核表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE和West-ern-blot检测到目... 采用PCR方法,从PCV2双拷贝DNA感染性克隆中扩增出PCV2 ORF1和ORF2截短基因,与pQE30原核表达载体分别经KpnI和HandIII双酶切,连接,经鉴定后证明成功构建pQE30-ORF1、pQE30-ORF2原核表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE和West-ern-blot检测到目的蛋白表达,为研究蛋白功能和单克隆抗体的研制打下了基础。 展开更多
关键词 pcv2 orf1 ORF2 截短 表达
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PCV2 Rep、截短Cap蛋白原核表达条件的优化及纯化蛋白的免疫原性 被引量:3
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作者 时建立 李俊 +5 位作者 吴家强 丛晓燕 孙文博 杜以军 王金宝 周顺 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期22-24,共3页
为得到纯化的Rep、截短Cap蛋白并确定其免疫原性,通过对前期构建的Rep、截短Cap蛋白原核表达载体进行原核表达条件的优化,最终确定诱导5 hI、PTG终浓度为1.5 mmol/L作为最佳的诱导条件,诱导表达Rep、截短Cap蛋白,用纯化试剂盒进行纯化,... 为得到纯化的Rep、截短Cap蛋白并确定其免疫原性,通过对前期构建的Rep、截短Cap蛋白原核表达载体进行原核表达条件的优化,最终确定诱导5 hI、PTG终浓度为1.5 mmol/L作为最佳的诱导条件,诱导表达Rep、截短Cap蛋白,用纯化试剂盒进行纯化,包被ELISA板和已经检测过的血清阳性样品符合率达到90%以上。 展开更多
关键词 pcv2 orf1 ORF2 优化条件 纯化 免疫原性
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果 被引量:2
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作者 祝卫国 王旭荣 +4 位作者 宋长绪 杨增岐 王建华 张春红 黄忠 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2008年第3期75-79,84,共6页
【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在... 【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行检测。【结果】得到了PCV2的ORF1和ORF2基因,pMD18-ORF1-ORF2和pAdCMV-ORF1-ORF2载体构建成功,获得了含有PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒。该重组腺病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中可检测到PCV2的特异性抗体。【结论】成功构建了含PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,此腺病毒可诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体。 展开更多
关键词 猪Ⅱ型圆环病毒 orf1 ORF2基因 重组腺病毒 免疫效果
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量:1
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作者 蒋智勇 宋长绪 +2 位作者 王贵平 高向阳 赵亚华 《动物医学进展》 CSCD 2004年第5期59-62,共4页
根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)0RF1基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(942 bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒,命名为pMD-ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核... 根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)0RF1基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(942 bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒,命名为pMD-ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/gⅢC,得到重组子,命名为pBAD/gⅢ-ORF1。测序分析表明克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性高达99.5%。与其它PCV2核苷酸序列同源性为92.1%-99.9%,推导的氨基酸序列同源性为90.2%-99.5%。同时,测序结果表明所克隆的ORF1准确插入pBAD/gⅢC的多克隆位点,未改变读码框架。用L-Arabi-nose进行诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE和Western blotting分析,显示PCV2 ORF1在pBAD/gⅢC中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为4.1万。 展开更多
关键词 猪Ⅱ型圆环病毒 orf1基因 基因克隆 大肠杆菌 基因表达
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PCV2逃逸宿主天然免疫的分子机制研究 被引量:8
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作者 张蕾 代松宝 +4 位作者 张丽琳 时培殿 王家顺 任婕 黄金海 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期149-156,共8页
为了探究PCV2抑制β干扰素(IFN-β)的分子机制,采用相对荧光定量的方法检测了PCV2感染PK-15细胞及PAM细胞后的白细胞介素、抗原提呈分子、模式识别受体、干扰素及其转录因子、DNA信号通路关键接头分子的转录表达,结果表明,PCV2感染引起... 为了探究PCV2抑制β干扰素(IFN-β)的分子机制,采用相对荧光定量的方法检测了PCV2感染PK-15细胞及PAM细胞后的白细胞介素、抗原提呈分子、模式识别受体、干扰素及其转录因子、DNA信号通路关键接头分子的转录表达,结果表明,PCV2感染引起β干扰素下调为主的天然免疫抑制。采用IFN-β启动子的荧光素酶报告检测系统检测PCV2感染PK-15细胞后IFN-β的表达情况,结果显示,PCV2感染不能激活IFN-β的转录,并且能够抑制Poly(d A∶d T)诱导的IFN-β转录,呈现PCV2接种剂量依赖性;为了探究PCV2编码的主要蛋白在天然免疫中的作用,构建了PCV2ORF1/ORF2/ORF3 pc DNA3.1真核表达载体,采用IFN-β-Luc、NF-кB-Luc、AP-1-Luc和IRF3-Luc启动子的荧光素酶报告系统检测PCV2 ORF1、ORF2、ORF3对干扰素的影响作用,结果显示,PCV2感染抑制IFN-β的产生,但其编码的蛋白ORF1和ORF2在调控方面特性相反,ORF1能够通过NF-кB激活干扰素,ORF2则可以通过IRF3、NF-кB抑制干扰素,ORF3对干扰素通路的影响不明显。研究表明,PCV2 ORF2可通过抑制干扰素产生影响机体先天性免疫反应。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf1 ORF2 天然免疫 IFN-Β
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一株高病毒载量PCV2毒株的基因组特征及序列分析 被引量:1
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作者 常鑫 蒋智勇 +4 位作者 卞志标 徐民生 杨冬霞 杨傲冰 翟少伦 《广东农业科学》 CAS 2024年第3期124-135,共12页
【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株的遗传进化情况,丰富PCV2分子流行病学数据,为当地PCV2疫苗候选株的选用和研发提供参考。【方法】使用qPCR方法对疑似PCV2的样品进行检测,发现1株具... 【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株的遗传进化情况,丰富PCV2分子流行病学数据,为当地PCV2疫苗候选株的选用和研发提供参考。【方法】使用qPCR方法对疑似PCV2的样品进行检测,发现1株具有高病毒载量的PCV2毒株,命名为GD222858。通过PCR方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。使用MegAlign软件将该毒株ORF1、ORF2基因编码的氨基酸序列与PCV2同亚型参考毒株进行比对,分析氨基酸序列的相似性;采用DNAStar预测该毒株的Cap蛋白二级结构及B细胞表位,并与4株疫苗株DBN-SX07-2(HM641752)、LG(HM038034)、SH(HM038027)、ZJ(AY686764)的Cap蛋白抗原指数进行比对分析。【结果】GD222858毒株基因组长度为1767 bp。遗传进化分析表明该毒株属于PCV2d亚型。与国内外82株参考毒株的核苷酸相似性为91.4%~99.6%,与越南毒株Han8(GenBank登录号:JQ181600)的亲缘关系最近。在ORF1编码的Rep蛋白处发现多个特异性突变位点F70Y、F77L、W202R、N256S;ORF2编码的Cap蛋白相对保守。Protean预测Cap蛋白的氨基酸第5~18、24~25、39~41、48~49、57~65、99、101、112~114、139~140、145~150、162~165、175~181、188~189、205~211、227~232位置处均可能存在潜在的B细胞表位。GD222858毒株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株均有差异,在氨基酸45~57、124~132、223~233位置处抗原指数明显高于4株疫苗株,且与疫苗株HM038034差异最大。【结论】GD222858毒株感染猪群的原因可能是Rep蛋白多个位点发生特异性突变及疫苗株选用不当所致。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(pcv2) 遗传进化分析 orf1基因 ORF2基因 B细胞表位 抗原指数
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猪圆环病毒2型Rep、Cap蛋白基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究 被引量:3
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作者 张福良 王双山 欧阳素贞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期775-778,共4页
采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中。经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV。重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组... 采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中。经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV。重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组产生重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ线性化后转染293细胞中包装成为完整的腺病毒。将构建的重组腺病毒按照每100μL1×107蚀斑单位(PFU)滴鼻2次免疫6~8周龄BALB/c小鼠,经尾部采血获得一免、二免血清。用ELISA方法检测结果表明,该重组腺病毒可以诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体,可作为候选基因工程疫苗进行本体动物免疫试验研究。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 重组腺病毒 免疫效果
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中国北方部分地区猪圆环病毒Ⅱ型分子流行病学调查 被引量:5
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作者 梅林 邢海云 +4 位作者 郭春丽 张社民 梁志选 赵建增 高英杰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第1期1-4,共4页
目的 分析中国北方部分地区猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的分子流行病学特征。方法收集2006~2008年间北京、山西、山东、河北4省(市)PCV2 DNA阳性病料共16份,分别进行PCV2 ORF1和ORF2核苷酸序列的扩增、克隆和测序... 目的 分析中国北方部分地区猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的分子流行病学特征。方法收集2006~2008年间北京、山西、山东、河北4省(市)PCV2 DNA阳性病料共16份,分别进行PCV2 ORF1和ORF2核苷酸序列的扩增、克隆和测序,并利用分子生物学软件进行分子遗传学分析。结果本研究中的16株PCV2 ORF1、ORF2核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考株的同源性分别为97.1%~99.8%和98.4%~99.7%及89.6%~99.4%和88.1%~99.1%;2006~2008年间中国北方与南方以及2002~2005年间北方的PCV2流行情况基本相似,绝大多数属于1AB基因亚群;近年来,中国北方流行的PCV2(1AB基因亚群)中,有11/14集中在单独一个侧枝;在中国北京出现了2C基因亚群的PCV2野毒株,经分析可能从欧洲国家引入。结论从基因水平来讲,PCV2 1AB基因亚群是目前最高效的疫苗株,但这种局面未来可能会发生改变。 展开更多
关键词 猪圆环病毒Ⅱ型 orf1 ORF2 序列分析
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