提高PCR产物克隆效率的几种途径 被引量：6

1

作者 史艳红 赵世民 孙勇如 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1994年第5期470-471,共2页

从提高ＰＣＲ产物纯度，增加产物特异性入手，较详细地分析了影响ＰＣＲ产物克隆效率的四个主要因素，并就每种影响因素给出了较为详尽的提高克隆效率的途径．

关键词 克隆效率 聚合酶链反应 DNA

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提高PCR产物及其克隆效率的几点方法与经验 被引量：6

2

作者 王志斌 郭三堆 《生物技术通报》 CAS CSCD 1999年第4期30-32,共3页

本文介绍了提高ＰＣＲ产物及其克隆效率的方法与经验：如，引物的设计、目的片段的回收、连接体系、利用引物上所设计的酶切位点克隆、通过平末端克隆，以及加快实验进程的技巧、出现问题如何设计查找原因等。

关键词 pcr产物 克隆效率 平末端连接 亚克隆

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高效热不对称交互式PCR技术克隆地黄基因 被引量：3

3

作者 周延清 王婉珅 +4 位作者 张喻 李静云 陈娟娟 苑璐璐 魏俊 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2015年第1期100-105,共6页

利用高效热不对称交互式PCR（hiTAIL-PCR）技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框（ORF）,编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合... 利用高效热不对称交互式PCR（hiTAIL-PCR）技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框（ORF）,编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合酶基因在DNA水平和氨基酸水平的同源性分别高达81%~91%和83%~99%,而且推测蛋白质具有纤维素合酶的结构域;另一个由385个bp组成,没有ORF,不编码蛋白质,但是,预测其包含启动子元件.这些结果表明使用hiTAIL-PCR技术可以克隆地黄基因,克隆的基因将为地黄基因分子作用机制和分子育种研究奠定基础. 展开更多

关键词 地黄 高效热不对称交互式pcr技术 基因克隆 启动子

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蛋白酶K消化PCR产物提高克隆效率 被引量：4

4

作者 刘建荣 赵晓瑜 静天玉 《河北大学学报（自然科学版）》 CAS 1997年第S1期36-39,共4页

利用蛋白酶K消化PCR产物人脾Ro多肽基因片段,从51个白色转化子中获得41株人脾Ro(SS-A)多肽基因阳性克隆,克隆阳性率由0提高到79％。证明该法是一种提高PCR产物克隆效率的有效方法。

关键词 蛋白酶K pcr产物 人脾Ro(SS-A)多肽基因片段 克隆效率

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以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4

5

作者 胡晓星 彭杰 +3 位作者 冯悦 刘丽 张阿梅 夏雪山 《生命科学研究》 CAS CSCD 2016年第3期189-195,共7页

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,... 在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。 展开更多

关键词 肠道病毒71型 VP1基因 高保守区 TAQMAN探针 荧光定量pcr 检测

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背包问题DNA算法的反应设计及其生物实现(英文) 被引量：4

6

作者 朱莹 任立红 +1 位作者 丁永生 Kongsuwan Kritaya 《计算机学报》 EI CSCD 北大核心 2008年第12期2207-2214,共8页

有关背包问题的DNA算法近年来得到重视,文中实现了求解背包问题的并行搜索解的实验,通过最优的方法完成有限容量背包的物品选择.展示了面向反应的DNA片段设计,计算过程为溶液DNA高效连接反应,反应结果分别用定量(PCR)和定性(测序)两种... 有关背包问题的DNA算法近年来得到重视,文中实现了求解背包问题的并行搜索解的实验,通过最优的方法完成有限容量背包的物品选择.展示了面向反应的DNA片段设计,计算过程为溶液DNA高效连接反应,反应结果分别用定量(PCR)和定性(测序)两种方法检测.文中的方法适用于多重约束条件的优化问题. 展开更多

关键词 背包问题 DNA计算 引物设计 高效连接 克隆测序

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GC克隆载体的制备及其克隆效率研究

7

作者 李继刚 杨忠祥 +1 位作者 张虎 孙希哲 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期66-69,共4页

为了研究GC克隆技术的克隆效率,从商品化T载体出发,构建了一个含有2个XcmI位点的质粒;通过PCR技术引入突变后,经XcmI酶切得到3′端各突出一个C碱基的线性化载体。随后将该线性化载体与Taq酶催化得到的PCR产物进行了连接测试。结果表明:G... 为了研究GC克隆技术的克隆效率,从商品化T载体出发,构建了一个含有2个XcmI位点的质粒;通过PCR技术引入突变后,经XcmI酶切得到3′端各突出一个C碱基的线性化载体。随后将该线性化载体与Taq酶催化得到的PCR产物进行了连接测试。结果表明:GC克隆效率低于同等条件下的TA克隆,对不同5′端碱基引物没有表现出明显偏好性。该研究为GC克隆技术在分子生物学实验上的应用提供了一定的理论依据。 展开更多

关键词 pcr产物 GC克隆 载体 酶切 克隆效率

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连接方法对重组效率影响的比较研究

8

作者 莫宁萍 岳昌武 +1 位作者 刘坤祥 凌锌 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第8期3155-3156,共2页

[目的]为探索一种适于连接PCR产物和不同粘端的新方法。[方法]分别采用冻融法、割胶法、试剂盒法和牙签法连接PCR产物与质粒DNA以及酶切产物与质粒DNA,比较不同连接方法对重组效率的影响。[结果]采用冻融法和割胶法连接PCR产物与pMD18-T... [目的]为探索一种适于连接PCR产物和不同粘端的新方法。[方法]分别采用冻融法、割胶法、试剂盒法和牙签法连接PCR产物与质粒DNA以及酶切产物与质粒DNA,比较不同连接方法对重组效率的影响。[结果]采用冻融法和割胶法连接PCR产物与pMD18-T,其连接效率分别为94.00%和93.00%,略高于试剂盒法和牙签法。采用冻融法和割胶法连接酶切产物的重组效率分别为86.67%和88.00%,略高于试剂盒法和牙签法。牙签法简化了连接前DNA相关操作,具有较高的连接效率,完全能够满足普通连接反应,特别是粘端连接反应要求。[结论]割胶法具有很高的重组效率和转化效率,可以满足普通连接反应、文库构建对连接效率和转化效率的要求,具有一定的应用前景。 展开更多

关键词 重组效率 转化 分子克隆 体外连接

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DNA克隆和组装技术研究进展 被引量：4

9

作者 史晏榕 孙宇辉 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期2229-2237,共9页

DNA克隆和组装技术是重要的分子生物学工具。近年来,随着合成生物学的飞速发展,对大片段DNA元件的快速有效组装就显得尤为关键。同时,各种DNA克隆和组装技术也竞相发展起来。通过对基于非典型酶切连接、PCR、同源重组、单链退火拼接等... DNA克隆和组装技术是重要的分子生物学工具。近年来,随着合成生物学的飞速发展,对大片段DNA元件的快速有效组装就显得尤为关键。同时,各种DNA克隆和组装技术也竞相发展起来。通过对基于非典型酶切连接、PCR、同源重组、单链退火拼接等原理发展起来的各种DNA克隆和组装技术进行综述,为合成生物学的进一步发展提供有效的操作工具。 展开更多

关键词 DNA克隆和组装 非典型酶切连接 pcr 同源重组 单链退火拼接

原文传递

GoldenBraid酶切连接反应体系的优化

10

作者 徐美慧 张耀杰 +1 位作者 唐克轩 苗志奇 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期266-274,共9页

旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系。通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系。结果显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体... 旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系。通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系。结果显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体系,1 mmol/L ATP,0.5μL FastDigest Esp3I或FastDigest Eco31I,元件供体载体与受体载体的摩尔比3∶1时,有效克隆比例接近99%,是优化前(BsmBI 8%、BsaI 23%)的4倍以上,此时酶切连接效率接近100%。与原始方案相比,通过体系的优化,可以在更少内切酶用量(原方案为1μL)的情况下,显著提高有效克隆比例,表明本方法能提高GB系统的酶切连接效率和实用性。 展开更多

关键词 GoldenBraid 优化 有效克隆 酶切连接效率

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多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因

11

作者 陈婉煜 刘君怡 +2 位作者 李国庆 刘媛媛 陈华波 《生物医学》 CAS 2022年第1期1-8,共8页

鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用... 鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。从双片段连接物中筛选出上百个菌落,经检测和序列测定,得到一个序列完全准确的克隆。对于难以直接克隆的长基因,可先扩增其各个片段,再将它们拼接成完整基因。其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,再辅以重叠延伸PCR融合法,即可实现多个基因片段的正确拼接。 展开更多

关键词 基因克隆 重叠延伸pcr 双片段连接法 人表皮生长因子受体2基因

暂未订购

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因(英文)

12

作者 王奕然 洪洁 +3 位作者 明明 丁建东 李庆国 黄伟达 《复旦学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期576-583,共8页

Halobacteriumspeciesxz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌,所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视.连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型... Halobacteriumspeciesxz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌,所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视.连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法.LPA法利用"酶切-连接-PCR"之组合,首先选定一组限制性内切酶,各自单独地酶切细菌总DNA样品,然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接.连接液混合起来,作为扩增未知序列DNA的模板.通过这种方法,克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0.4kb上游调控区域的总长度1.3kb的DNA片段.实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法,可以快速有效地获得目标基因相关的序列. 展开更多

关键词 克隆 古紫质 连接反应介导的pcr扩增法 接头 半嵌套式pcr

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