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CD59分子W40位点基因缺失的构建与活性检测 被引量：2
1
作者 朱新红 高美华 +4 位作者 王秋波 任书荣 王静 张艳丽 张丽 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期295-299,共5页
目的:构建突变型CD59重组质粒,建立高效真核表达系统,探讨W40位点的生物学活性。方法:采用基因点突变技术使CD59W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建的CD59cDNA为模板,三重PCR(Overlap PCR)定点诱变扩增突... 目的:构建突变型CD59重组质粒,建立高效真核表达系统,探讨W40位点的生物学活性。方法:采用基因点突变技术使CD59W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建的CD59cDNA为模板,三重PCR(Overlap PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切野生型和突变型CD59基因,重组入真核表达质粒pIRES,利用阳离子脂质体(Lipfectamine2000)将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达。结果:通过PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因MCD59,酶切鉴定及序列测定证实成功构建了pIRES-MCD59,转染CHO细胞,G418筛选出了稳定细胞克隆,检测筛选MCD59蛋白高表达株。免疫组化、免疫荧光、SDS-PAGE、ELISA验证CD59的表达;荧光染料释放试验研究显示与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能。结论:CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。 展开更多
关键词 CD59 基因突变 真核表达 overlappcr 补体
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基于Overlap PCR方法进行猪伪狂犬病毒TK基因缺失载体的构建、鉴定及生物学分析 被引量：7
2
作者 毕研丽 郭广君 +2 位作者 吕素芳 魏凤 沈志强 《中国动物检疫》 CAS 2011年第2期40-43,共4页
构建伪狂犬病毒TK基因缺失载体,在BHK-21细胞中表达,为研究TK基因生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。根据伪狂犬病病毒SA株TK基因序列,设计引物,通过OverlapPCR扩增到长约1814bp的TK基因,与PMD18-T载体连接,将鉴定为阳性的... 构建伪狂犬病毒TK基因缺失载体,在BHK-21细胞中表达,为研究TK基因生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。根据伪狂犬病病毒SA株TK基因序列,设计引物,通过OverlapPCR扩增到长约1814bp的TK基因,与PMD18-T载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pMD-TK与表达载体pBluescriptSK(+)分别用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切后,定向亚克隆;重组表达质粒pBTK经PCR、酶切鉴定后,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性重组质粒pBTK转染BHK-21细胞,通过噬斑纯化获得获得重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传15代后仍具有良好的遗传稳定性,应用PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞基因组中扩增到TK基因,其TCID50毒价是5.75。本实验为PRV基因功能的研究及PRV基因缺失苗的研究提供了基础。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 TK基因 overlappcr 转移载体
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