为探究羊口疮病毒(ORFV)129蛋白对NF-κB信号通路介导的宿主细胞因子转录水平的影响,本研究首先设计并合成山羊4种细胞因子基因特异性引物,分别以构建的4种细胞因子重组质粒为模板,经条件优化建立了检测山羊4种细胞因子的SYBR Green I...为探究羊口疮病毒(ORFV)129蛋白对NF-κB信号通路介导的宿主细胞因子转录水平的影响,本研究首先设计并合成山羊4种细胞因子基因特异性引物,分别以构建的4种细胞因子重组质粒为模板,经条件优化建立了检测山羊4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。结果显示,所建立的4种细胞因子SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法熔解曲线呈单一峰,无引物二聚体;4种细胞因子重组质粒标准品最低检测限分别为IL-6:1.40×10^(2)拷贝/μL、IL-1β:1.92×10^(2)拷贝/μL、IFN-γ:1.69×10^(2)拷贝/μL、TNF-α:2.31×10^(1)拷贝/μL;组内及组间变异系数在0.1%~2.3%。表明所建立的山羊4种细胞因子荧光定量RT-PCR特异性强,灵敏度高,稳定性好,可用于4种细胞因子mRNA转录水平的检测。随后本研究将包含编码ORFV 129完整蛋白基因的重组质粒pEGFP-ORFV 129和pEGFP-N1空质粒分别转染山羊睾丸支持细胞(GTSCs)24 h后,用终浓度20 ng/mL的TNF-α刺激转染细胞6 h后收集细胞,利用建立的荧光定量RT-PCR方法检测GTSCs中IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α共4种细胞因子mRNA的转录水平,结果显示,与转染pEGFP-N1空载的细胞相比,转染了pEGFP-ORFV 129重组质粒的细胞IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的转录水平均极显著下降(p<0.001),该细胞中TNF-α的mRNA转录水平也下降,但与对照组相比差异不显著(p>0.1),表明ORFV 129蛋白能够抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平。本研究通过建立山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量PCR方法,首次检测证实了ORFV 129蛋白不同程度地抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平,为ORFV129蛋白功能研究奠定了基础。展开更多
文摘为探究羊口疮病毒(ORFV)129蛋白对NF-κB信号通路介导的宿主细胞因子转录水平的影响,本研究首先设计并合成山羊4种细胞因子基因特异性引物,分别以构建的4种细胞因子重组质粒为模板,经条件优化建立了检测山羊4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。结果显示,所建立的4种细胞因子SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法熔解曲线呈单一峰,无引物二聚体;4种细胞因子重组质粒标准品最低检测限分别为IL-6:1.40×10^(2)拷贝/μL、IL-1β:1.92×10^(2)拷贝/μL、IFN-γ:1.69×10^(2)拷贝/μL、TNF-α:2.31×10^(1)拷贝/μL;组内及组间变异系数在0.1%~2.3%。表明所建立的山羊4种细胞因子荧光定量RT-PCR特异性强,灵敏度高,稳定性好,可用于4种细胞因子mRNA转录水平的检测。随后本研究将包含编码ORFV 129完整蛋白基因的重组质粒pEGFP-ORFV 129和pEGFP-N1空质粒分别转染山羊睾丸支持细胞(GTSCs)24 h后,用终浓度20 ng/mL的TNF-α刺激转染细胞6 h后收集细胞,利用建立的荧光定量RT-PCR方法检测GTSCs中IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α共4种细胞因子mRNA的转录水平,结果显示,与转染pEGFP-N1空载的细胞相比,转染了pEGFP-ORFV 129重组质粒的细胞IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的转录水平均极显著下降(p<0.001),该细胞中TNF-α的mRNA转录水平也下降,但与对照组相比差异不显著(p>0.1),表明ORFV 129蛋白能够抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平。本研究通过建立山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量PCR方法,首次检测证实了ORFV 129蛋白不同程度地抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平,为ORFV129蛋白功能研究奠定了基础。
