猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因在毕赤酵母中的表达 被引量：4

1

作者 钱平 周艳君 +5 位作者 童光志 仇华吉 王云峰 吴丹 薛强 陈焕春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期161-162,共2页

根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5’端的二级结构等特性 ,对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成 ,然后以正确的读码框架插入到分泌型酵母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽... 根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5’端的二级结构等特性 ,对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成 ,然后以正确的读码框架插入到分泌型酵母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽编码序列 3’端 ,构建成酵母转移载体 ,用化学方法转化受体酵母菌GS115 ,经PCR和酶切鉴定证实 ,目的基因已整合到重组酵母菌染色体中。对重组酵母进行诱导表达 ,并通过SDS_PAGE和Westernblot分析进行筛选 ,获得了一株高效表达目的蛋白的重组酵母菌 ,该重组蛋白具有免疫学活性 ,其表达水平可达 2 .0g/L 。 展开更多

关键词 猪 繁殖能力 呼吸综合征 病毒 orf6基因 毕赤酵母 基因表达

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斑点叉尾病毒囊膜蛋白ORF6在昆虫细胞中的表达 被引量：5

2

作者 黄锋涛 熊海林 +6 位作者 曹胜波 熊传喜 王敏 王卫民 吴兵 刘玉林 刘学芹 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期1034-1039,共6页

为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该... 为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状病毒介导下在昆虫细胞中表达,从而为基于CCV ORF6的杆状病毒亚单位疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 斑点叉尾鮰病毒 orf6蛋白 杆状病毒 昆虫细胞 表达

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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/ORF6基因重组鸡痘病毒的构建与小鼠免疫试验 被引量：5

3

作者 韩松 金宁一 +4 位作者 鲁会军 金扩世 南文龙 牟伟峰 赵翠青 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期1-5,共5页

本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表... 本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSV ELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IFN-γ的分泌显著提高。结果表明,所构建重组鸡痘病毒可以对小鼠起到良好的免疫效果,具有成为抗PRRSV感染新型疫苗的潜力。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5/orf6基因 鸡痘病毒载体 免疫试验

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备 被引量：2

4

作者 郑其升 杨瑞锋 +4 位作者 毕志香 李鹏 于春梅 曹瑞兵 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期154-158,共5页

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原... 根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达载体pET-ORF6。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSVORF6基因获得表达。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体。经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应。兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株 orf6基因 原核表达 抗体制备

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两株高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因克隆及序列分析 被引量：5

5

作者 时建立 李俊 +3 位作者 徐绍建 赵鸿雁 张秀美 王金宝 《中国畜牧兽医》 CAS 2008年第1期39-43,共5页

应用RT—PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7，将其分别克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列，并与VR-2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较，并绘制系统进化树，结... 应用RT—PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7，将其分别克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列，并与VR-2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较，并绘制系统进化树，结果ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型的同源性为91．1％～100％，与欧洲型的同源性为66．2％～70．7％，推导氨基酸与北美洲型的同源性为91．2％～100％，与欧洲型的同源性为62．3％～82．3％。证明新分离到的PRRSVSX株、ZQ株仍属北美洲型。SX株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．8％、100％；ZQ株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．6％、99．7％。 展开更多

关键词 高致病性PRRSV orf6 ORF7 克隆 序列分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达 被引量：4

6

作者 王娇 孙继国 +3 位作者 陈赛娟 刘涛 王坤 赵泽坤 《中国动物检疫》 CAS 2009年第4期34-36,共3页

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩... 从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 河北分离株 orf6基因 原核表达

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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达 被引量：1

7

作者 李俊 符芳 +4 位作者 袁小远 崔尚金 童光志 温建新 王金宝 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期471-475,共5页

为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获... 为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株。以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和West-ern blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 SD2株 ORF5/orf6 CHO 蛋白的表达

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山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征 被引量：1

8

作者 李俊 徐绍建 +3 位作者 时建立 吴家强 温建新 王金宝 《家畜生态学报》 2009年第4期76-80,共5页

采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源... 采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明：该10株病毒仍属北美洲型,其中2001-2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株（VR-2332株）和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006-2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%-100%,99.4%-99.8%,99.2%-99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株（JXA1、Shanghai、HEB1）同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。 展开更多

关键词 PRRSV 高致病性PRRSV ORF5 orf6 ORF7 克隆 分子特征

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斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析 被引量：1

9

作者 刘玉林 王卫民 +1 位作者 王敏 李莉娟 《湖北农业科学》 北大核心 2011年第5期1001-1003,1048,共4页

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得... 利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。 展开更多

关键词 斑点叉尾鮰病毒 orf6基因 高效可溶表达 抗原性

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稳定表达PRRSV ORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及其生物学特性 被引量：2

10

作者 杨亚东 张俊峰 +8 位作者 张春杰 陈松彪 程相朝 廖成水 刘莎莎 王二鑫 张晓洁 尚珂 汪洋 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期47-53,共7页

为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序... 为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序结果表明,成功构建了重组质粒p YA3493-ORF5-ORF6。将该重组质粒电转至减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1基因缺失株,获得PRRSVORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6),并对该重组减毒猪霍乱沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。进一步对重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)研究发现,其生长速度比强毒株C78-1明显减慢,与ΔcrpΔcyaΔasd C78-1缺失株及ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)互补菌株基本一致。在体外连续传代能够稳定遗传ORF5-ORF6融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到ORF5-ORF6蛋白条带,且经Western-blot分析证实,重组菌共表达的GP5和M蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。以上结果表明,能稳定携带ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)构建成功,为开发猪繁殖与呼吸综合征和仔猪副伤寒基因工程二联疫苗奠定了良好基础。 展开更多

关键词 PRRSV ORF5-orf6 减毒猪霍乱沙门菌 二联疫苗 生物学特性

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PRRSV变异株ORF6基因与IL-18共表达真核质粒的构建及其表达 被引量：1

11

作者 王晓莉 李志杰 +3 位作者 丁壮 张泉鹏 宣华 王贵平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1282-1285,1290,共5页

针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳... 针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳性质粒转染Marc-145细胞进行筛选。通过表达载体在转染细胞中的高效转染,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)快速、准确的反映出阳性质粒在细胞质中的正确表达,再通过SDS-PAGE和Western blot鉴定构建的真核表达质粒pEGFP-IL18-ORF6的正确性。结果表明,ORF6基因和IL-18基因在Macr-145细胞中能有效表达。结论,所构建的真核质粒pEGFP-IL18-ORF6结构正确,能够在Marc-145细胞中高效表达,而且表达产物具有特异免疫学反应。 展开更多

关键词 PRRSV 真核质粒pEGFP-IL18-orf6 表达

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高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因的遗传变异分析 被引量：1

12

作者 张婷 布日额 +2 位作者 张永富 赵景海 郎景民 《内蒙古民族大学学报（自然科学版）》 2009年第3期313-317,共5页

从GenBank中选取8株国内报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株,应用DNAStar软件对其ORF6、ORF7基因序列进行分析,与VR-2332株、LV株、国内及周边国家分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树.结果表明,高致病性猪... 从GenBank中选取8株国内报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株,应用DNAStar软件对其ORF6、ORF7基因序列进行分析,与VR-2332株、LV株、国内及周边国家分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树.结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的ORF6、ORF7核苷酸与VR-2332株的同源性为95.1%-95.4%、93.8%-94.1%,与欧洲型（LV）的同源性为69.4%-69.6%、67.9%-68.5%;ORF6、ORF7推导氨基酸与VR-2332株的同源性为97.7%、94.4%-95.2%,与欧洲型（LV）的同源性为80.0%-80.6%、65.3%-66.1%.系统进化树表明,8株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株仍属于美洲型.说明猪繁殖与呼吸综合征病毒不断变异的现今,ORF6和ORF7基因依然高度保守. 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高致病性 orf6 ORF7 遗传变异

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肺炎支原体ORF6区蛋白重组抗原制备及在血清学诊断中的初步应用

13

作者 王惠榕 高岚美 +2 位作者 萧剑雄 严延生 张春阳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期615-619,624,共6页

目的本文应用肺炎支原体ORF6区重组抗原建立酶联免疫吸附实验(ELISA),用于检测肺炎支原感染者IgM抗体。方法通过已构建的质粒表达重组蛋白,用电洗脱法纯化后建立ELISA试验,并检测临床标本224份,与国外2种商品化试剂盒检测结果对照,初步... 目的本文应用肺炎支原体ORF6区重组抗原建立酶联免疫吸附实验(ELISA),用于检测肺炎支原感染者IgM抗体。方法通过已构建的质粒表达重组蛋白,用电洗脱法纯化后建立ELISA试验,并检测临床标本224份,与国外2种商品化试剂盒检测结果对照,初步考核检测方法的敏感性和特异性。结果与进口试剂盒相比阳性率基本相符,统计分析无显著差异。结论研究建立的间接ELISA方法特性强、敏感度高,为试剂盒的研制与开发奠定了基础。 展开更多

关键词 肺炎支原体 orf6区 蛋白表达 ELISA

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猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4ORF6基因的克隆与序列分析

14

作者 陈声 杨汉春 +2 位作者 郭鑫 高云 查振林 《动物医学进展》 CSCD 2001年第3期55-58,共4页

将猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRS)病毒 BJ- 4株在 HS.2 H细胞上增殖 ,经超速离心浓缩病毒。用 TRIZOL LS试剂提取病毒基因组 RNA后 ,用 RT- PCR方法特异性扩增 PRRS病毒 BJ- 4的 ORF6基因片段 ;经Sma 酶切鉴定正确后 ,将 PCR产物克隆到p GE... 将猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRS)病毒 BJ- 4株在 HS.2 H细胞上增殖 ,经超速离心浓缩病毒。用 TRIZOL LS试剂提取病毒基因组 RNA后 ,用 RT- PCR方法特异性扩增 PRRS病毒 BJ- 4的 ORF6基因片段 ;经Sma 酶切鉴定正确后 ,将 PCR产物克隆到p GEM- Teasy载体上 ,经 Amp/IPTG/X- Gal平板筛选、酶切鉴定和质粒 PCR鉴定 ,初步获得含 ORF6基因的阳性重组质粒 p GEM-T- ORF6。对重组质粒进行序列测定 ,并同美洲代表株 VR2 332和欧洲代表株 L V进行比较 ,结果表明 ,BJ- 4 ORF6与 VR2 332的ORF6差异较小 ,核苷酸和氨基酸同源性均为 99.43% ;而与 L V株的差异性较大 ,核苷酸同源性为 70 .6 % ,氨基酸同源性为 77.4% 展开更多

关键词 猪 繁殖呼吸综合征病毒 orf6基因 克隆 序列分析

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肺炎支原体ORF6区基因的克隆与表达

15

作者 王惠榕 萧剑雄 严延生 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期414-417,共4页

目的表达肺炎支原体ORF6区基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增ORF6区基因,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET-32a... 目的表达肺炎支原体ORF6区基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增ORF6区基因,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的蛋白的表达结果。结果获得肺炎支原体ORF6区基因长为1003bp的DNA片段,SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量56.8kDa处有阳性表达条带。免疫印迹显示,该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应。结论ORF6区基因在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白具有免疫反应性。 展开更多

关键词 肺炎支原体 orf6区 基因 克隆 表达

暂未订购

PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

16

作者 李俊 王金宝 +4 位作者 袁小远 崔尚金 李曦 符芳 周艳君 《动物医学进展》 CSCD 2006年第10期78-81,共4页

以PRRSV细胞培养物为模板,经RT-PCR扩增得到ORF5/ORF6基因,该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切,连接构建pIRES-ORF5/ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5/ORF6。测得的ORF5/ORF6序列与VR-2332株的... 以PRRSV细胞培养物为模板,经RT-PCR扩增得到ORF5/ORF6基因,该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切,连接构建pIRES-ORF5/ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5/ORF6。测得的ORF5/ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99%和100%,属北美洲型。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征 SD2株 ORF5/orf6基因 转移载体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

17

作者 刘永宏 刘月焕 +7 位作者 王凤龙 韩春华 林健 王金玲 杨龙峰 赵丽 张秋雨 张永富 《中国动物检疫》 CAS 2009年第7期29-32,共4页

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PC... 根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 变异株 orf6基因 克隆 原核表达

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空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中作用的研究

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作者 佟颖 邓小虹 +3 位作者 石伟先 王劲 肖潇 慈九正 《中国卫生检验杂志》 CAS 2003年第6期673-677,共5页

〔目的〕研究空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中的作用。〔方法〕通过同源搜索 ,推测基因ORF6的可能功能 ;通过PCR扩增基因ORF6,将基因ORF6插入质粒载体pBluescript中 ,再通过抗卡那霉素弹夹的插入 ,使基因ORF6失活 ;通过自... 〔目的〕研究空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中的作用。〔方法〕通过同源搜索 ,推测基因ORF6的可能功能 ;通过PCR扩增基因ORF6,将基因ORF6插入质粒载体pBluescript中 ,再通过抗卡那霉素弹夹的插入 ,使基因ORF6失活 ;通过自然转移 ,失活的ORF6基因与野生株空肠弯曲菌的常染色体融合而产生突变株 ;通过银染色、蛋白质印迹对突变株脂多糖进行分析 ;结合同源搜索的结果 ,推测基因ORF6的可能功能。〔结果〕ORF6DNA序列与鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和脆弱类杆菌 (Bacteroidesfragilis)的转氨酶基因相似 ;通过自然转移得到基因ORF6失活突变株 ;基因ORF6突变株的脂多糖比野生株的脂多糖短 ,基因ORF6的改变影响空肠弯曲菌血清反应。〔结论〕基因ORF6在脂多糖的生物合成中起着重要作用 ;基因ORF6很可能是一种氨基转移酶。 展开更多

关键词 空肠弯曲菌 脂多糖 orf6基因 生物合成 PCR 氨基转移酶

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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因核酸疫苗的构建

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作者 薛娜 沈国顺 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第1期92-94,共3页

为了进一步研究PRRSV新型疫苗,为有效控制PRRSV,试验采用RT-PCR的方法扩增出PRRSV M蛋白基因片段ORF6,将该基因克隆到pMD18-T载体,并通过序列分析软件对其核苷酸和氨基酸同源性进行分析。在此基础上以pIRES-neo为载体,构建含有ORF6基因... 为了进一步研究PRRSV新型疫苗,为有效控制PRRSV,试验采用RT-PCR的方法扩增出PRRSV M蛋白基因片段ORF6,将该基因克隆到pMD18-T载体,并通过序列分析软件对其核苷酸和氨基酸同源性进行分析。在此基础上以pIRES-neo为载体,构建含有ORF6基因的重组核酸疫苗质粒pIRES-ORF6。结果表明:该PRRSV辽宁分离株属于北美型毒株,重组核酸疫苗质粒pIRES-ORF6构建成功。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf6基因 核酸疫苗 免疫

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PRRSV ORF6及IL-18基因重组真核质粒试验免疫研究 被引量：4

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作者 牛伟 王中华 +3 位作者 王晓莉 宋德武 母连志 丁壮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1691-1694,共4页

将本实验室构建的重组质粒接种PRRSV的自然宿主断奶仔猪,分析其诱发细胞免疫和体液免疫应答的能力。结果表明:重组质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6免疫组在首免后14d开始产生特异性抗体,且其产生抗体水平随时间呈上升趋势,但pEGFP-ORF6... 将本实验室构建的重组质粒接种PRRSV的自然宿主断奶仔猪,分析其诱发细胞免疫和体液免疫应答的能力。结果表明:重组质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6免疫组在首免后14d开始产生特异性抗体,且其产生抗体水平随时间呈上升趋势,但pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6两组之间产生抗体差异不显著(P>0.05)。中和抗体检测结果显示只有pEGFP-ORF6在首免后42d有低水平的中和抗体产生。细胞免疫检测结果表明,pEGFP-IL18-ORF6诱导T淋巴细胞增殖和促进IFN-γ和IL-2的分泌的能力显著高于pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18(P<0.05),表明IL-18有效地发挥了分子其佐剂的效用,能增强细胞免疫应答并介导较好的Th1类免疫反应。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf6基因 IL-18 实验免疫

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