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ORAI2通过MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt通路促进BMP9诱导的MEFs成骨分化
1
作者 任轶凡 兰钰 +3 位作者 彭鑫亮 杨星宇 高翔 杜宇 《骨科》 2025年第4期289-297,共9页
目的 本研究旨在鉴定与骨形态发生蛋白9(BMP9)有协同促成骨作用的新因子,以期为骨质疏松症的治疗提供新的分子靶点和实验依据。方法 为系统性评价钙释放激活钙调节蛋白2(ORAI2)在成骨分化中的功能,本研究构建了ORAI2过表达及沉默的细胞... 目的 本研究旨在鉴定与骨形态发生蛋白9(BMP9)有协同促成骨作用的新因子,以期为骨质疏松症的治疗提供新的分子靶点和实验依据。方法 为系统性评价钙释放激活钙调节蛋白2(ORAI2)在成骨分化中的功能,本研究构建了ORAI2过表达及沉默的细胞模型,在机制研究中,我们通过RNA测序(RNA-seq),利用实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹(Western blotting)验证关键分子的表达变化;借助碱性磷酸酶(ALP)染色及活性分析评估细胞成骨状态。结果 研究发现,ORAI2在BMP9诱导的鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)成骨分化过程中的表达显著上调,而在骨质疏松(卵巢切除)大鼠模型中的表达下调。体外过表达ORAI2能有效促进成骨分化,相反,沉默ORAI2则显著抑制成骨分化。RNAseq及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示,PI3K/Akt是介导ORAI2功能的关键信号通路。此外,通过蛋白质谱分析鉴定出含IQ基序GTP酶激活蛋白1(IQGAP1)是ORAI2的结合蛋白,ORAI2通过与IQGAP1结合特异性地激活了MAPK/ERK1/2信号通路。结论 ORAI2通过与BMP9协同,经PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2通路促进成骨分化,是骨质疏松症的潜在治疗靶点。 展开更多
关键词 钙释放激活钙调节蛋白2 骨形态发生蛋白9 含IQ基序GTP酶激活蛋白1 成骨分化 间充质干细胞
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Orai2参与了HUVEC外钙敏感受体介导的Ca^(2+)内流和NO生成 被引量：2
2
作者 王腊梅 钟华 +4 位作者 赵慧 王静 庞丽娟 孙志萍 何芳 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2014年第5期595-601,共7页
目的研究钙释放激活的钙调素2(Orai2)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞外钙敏感受体(CaR)介导Ca2+内流和一氧化氮(NO)生成中的作用。方法 1)用转染技术将构建的Orai2干扰质粒(Orai2shRNA)转染入HUVEC,用实时定量RT-PCR和Western blot检测O... 目的研究钙释放激活的钙调素2(Orai2)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞外钙敏感受体(CaR)介导Ca2+内流和一氧化氮(NO)生成中的作用。方法 1)用转染技术将构建的Orai2干扰质粒(Orai2shRNA)转染入HUVEC,用实时定量RT-PCR和Western blot检测Orai2 mRNA和蛋白的表达。2)取2~5代HUVEC,分别以精胺激活CaR(钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)均激活)、ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)+CaR负性变构调节剂Calhex231(激活ROC及阻断SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967(阻断ROC及激活SOC)为细胞模型。实验分为3组:特异性质粒转染组(Orai2shRNA组),未转染组(空白对照组),空质粒组(vehicle组),用荧光探针Fura-2/AM、DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO的生成。结果 1)与control组相比,shOrai2-71干扰后,Orai2 mRNA和蛋白的表达均明显降低,抑制率分别为75.75%和70.58%(P<0.05)。2)与对照组和空质粒组相比,在4种不同处理因素作用下,Orai2shRNA转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05)。结论 Orai2参与了HUVEC中CaR经SOC和ROC激活介导的Ca2+内流和NO生成。 展开更多
关键词 orai2 一氧化氮 钙离子 人脐静脉内皮细胞
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Orai2对成骨细胞增殖、凋亡及分化的作用研究 被引量：2
3
作者 郭云山 郝定均 +4 位作者 王晓东 胡慧敏 姜扩 黄研生 杨小卫 《实用骨科杂志》 2019年第12期1092-1097,1109,共7页
目的本研究旨在明确钙通道蛋白Orai2在调控成骨细胞增殖、凋亡以及分化方面发挥的作用。方法在成骨诱导条件下用Western blot和Real-Time PCR的方法检测Orai2的蛋白表达和mRNA转录水平。应用靶向Orai2的shRNA在MC3T3-E1成骨细胞中沉默Or... 目的本研究旨在明确钙通道蛋白Orai2在调控成骨细胞增殖、凋亡以及分化方面发挥的作用。方法在成骨诱导条件下用Western blot和Real-Time PCR的方法检测Orai2的蛋白表达和mRNA转录水平。应用靶向Orai2的shRNA在MC3T3-E1成骨细胞中沉默Orai2的表达,转染无关干涉的shRNA作为阴性对照,将MC3T3-E1成骨细胞分为对照组和Orai2 shRNA组。在对照组和Orai2 shRNA组中,用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡变化、Real-Time PCR检测Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和锌指结构转录因子(Osterix)以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的转录水平,并用Western Blot检测Ras-ERK1/2信号通路活性。结果成骨诱导后Orai2的蛋白表达水平和mRNA转录水平逐渐增加(P<0.05)。与对照组相比较,转染靶向Orai2的shRNA后,MC3T3-E1细胞中Orai2的表达和转录均明显降低(P<0.05)。与对照组相比较,在MC3T3-E1细胞中沉默Orai2的表达后,MC3T3-E1细胞增殖减少、凋亡增加,并且Runx2和Osterix以及ALP的转录水平也显著下降(P<0.05);进一步研究发现,与对照组相比较,在MC3T3-E1细胞沉默Orai2的表达后,明显抑制了钙离子依赖的Ras-ERK1/2信号通路的活性(P<0.05)。结论Orai2的表达抑制可显著降低Ras-ERK1/2信号通路活性,并减少成骨细胞增殖、增加成骨细胞凋亡、抑制成骨分化,从而导致成骨细胞数量减少,参与骨质疏松症的发生与发展。 展开更多
关键词 orai2 增殖 凋亡 分化 成骨细胞
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Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用
4
作者 夏孝强 崔义元 +1 位作者 李芳华 陈米娜 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期965-968,共4页
目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究。方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai... 目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究。方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai2的pGEX-6p-1-Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Orai2融合蛋白表达,经固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩,获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白。SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blot检测抗体效价和特异性,并进行Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定。结果:经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高,BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度约0.35 mg/ml。抗Orai2多抗抗体效价达1∶10 000。能特异性识别转染真核细胞获得的过表达Orai2,以及小鼠脑组织内源性的Orai2蛋白,而不与Orai1发生交叉反应。同时,用自制的Orai2多克隆抗体检测发现,与同窝野生型小鼠相比,Orai2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低。结论:成功表达并纯化了GST-Orai2融合蛋白,获得了高敏感度、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体,该抗Orai2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性Orai2蛋白,能对Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定,且与Orai1没有交叉反应,为进一步研究Orai2功能奠定了基础。 展开更多
关键词 orai2 多克隆抗体 过表达 内源性 敲除小鼠鉴定
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