目的探讨CRISPR/CAS9靶向敲除Oct3/4基因后化疗药物索拉菲尼(Sorafenib)对肝癌细胞的作用影响。方法通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405和人肝正常细胞LX-2中Oct3/4的表达水平。通过CRISPR设计工...目的探讨CRISPR/CAS9靶向敲除Oct3/4基因后化疗药物索拉菲尼(Sorafenib)对肝癌细胞的作用影响。方法通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405和人肝正常细胞LX-2中Oct3/4的表达水平。通过CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu/)设计靶向Oct3/4的gRNA,并通过CRISPR/CAS9技术敲除肝癌细胞HepG2的Oct3/4,评估Oct3/4缺失情况下,化疗药物Sorafenib对肝癌细胞HepG2的凋亡水平和DNA损伤水平的影响。结果Oct3/4在人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的mRNA表达水平显著高于人肝正常细胞LX-2(P<0.05);同时,Oct3/4在人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的蛋白表达水平也显著高于人肝正常细胞LX-2。使用CRISPR/CAS9对HepG2细胞进行基因编辑后,挑取嘌呤霉素筛选出的2个单克隆细胞株进行Oct3/4表达水平的检测,1#号单克隆细胞株Oct3/4表达水平低于野生型WT,2#号单克隆细胞株没有表达Oct3/4。测序后发现1#号基因组上的Oct3/4第1个外显子只有1条染色体缺失了2个碱基,另一条染色体并未缺失;2#号基因组上的Oct3/4第1个外显子2条染色体均存在不同程度的缺失,一条缺失2个碱基,另一条缺失4个碱基。使用Sorafenib处理野生型HepG2细胞和2#Oct3/4 KO HepG2细胞后,Oct3/4 KO细胞株的凋亡水平显著上升(P<0.05),DNA损伤水平显著上升(P<0.05)。结论Oct3/4基因的敲除能够显著提高化疗药物Sorafenib促肝癌细胞凋亡和DNA损伤的作用。展开更多
文摘目的探讨CRISPR/CAS9靶向敲除Oct3/4基因后化疗药物索拉菲尼(Sorafenib)对肝癌细胞的作用影响。方法通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405和人肝正常细胞LX-2中Oct3/4的表达水平。通过CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu/)设计靶向Oct3/4的gRNA,并通过CRISPR/CAS9技术敲除肝癌细胞HepG2的Oct3/4,评估Oct3/4缺失情况下,化疗药物Sorafenib对肝癌细胞HepG2的凋亡水平和DNA损伤水平的影响。结果Oct3/4在人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的mRNA表达水平显著高于人肝正常细胞LX-2(P<0.05);同时,Oct3/4在人肝癌细胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的蛋白表达水平也显著高于人肝正常细胞LX-2。使用CRISPR/CAS9对HepG2细胞进行基因编辑后,挑取嘌呤霉素筛选出的2个单克隆细胞株进行Oct3/4表达水平的检测,1#号单克隆细胞株Oct3/4表达水平低于野生型WT,2#号单克隆细胞株没有表达Oct3/4。测序后发现1#号基因组上的Oct3/4第1个外显子只有1条染色体缺失了2个碱基,另一条染色体并未缺失;2#号基因组上的Oct3/4第1个外显子2条染色体均存在不同程度的缺失,一条缺失2个碱基,另一条缺失4个碱基。使用Sorafenib处理野生型HepG2细胞和2#Oct3/4 KO HepG2细胞后,Oct3/4 KO细胞株的凋亡水平显著上升(P<0.05),DNA损伤水平显著上升(P<0.05)。结论Oct3/4基因的敲除能够显著提高化疗药物Sorafenib促肝癌细胞凋亡和DNA损伤的作用。
