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NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响 被引量:9
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作者 刘启才 方嬿 +2 位作者 李晓艳 梁卫江 曾益新 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第7期725-728,共4页
背景与目的:NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号:BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD1)的影响。方法:通过核... 背景与目的:NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号:BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD1)的影响。方法:通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRc/CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD1和NF-κB转录活性的影响;同时亚克隆NP9基因编码序列到载体pEGFP-C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果:融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46%和63%。结论:NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-κB的转录活性下调cyclinD1的表达。 展开更多
关键词 np9基因 克隆 细胞周期素D1 转录活性 影响 鼻咽肿瘤
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NP9对鼻咽癌细胞系CNE1基因表达谱的影响 被引量:3
2
作者 刘启才 李晓艳 +2 位作者 彭燕 李晓岩 李冰 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期982-985,共4页
目的:确定NP9表达对鼻咽癌CNE1细胞基因表达谱的影响。方法:稳定表达NP9基因和稳定转染空载体的CNE1细胞分别作为基因芯片分析的实验组和对照组,用高通量的基因芯片筛选实验组细胞的差异表达基因,荧光定量逆转录PCR验证部分基因表达差... 目的:确定NP9表达对鼻咽癌CNE1细胞基因表达谱的影响。方法:稳定表达NP9基因和稳定转染空载体的CNE1细胞分别作为基因芯片分析的实验组和对照组,用高通量的基因芯片筛选实验组细胞的差异表达基因,荧光定量逆转录PCR验证部分基因表达差异。结果:所分析的14500个基因中,266个检测出有表达差异,其中82个基因呈现表达上调(RA>1),184个基因显示表达下调(RA<1)。显著上调和下调的基因分别为34个(RA>1.5)和75个(RA<1.5)。结论:NP9基因的表达导致了CNE1细胞中与细胞周期调控、细胞增殖和分化、细胞信号转导、细胞黏附相关基因表达的改变,为NP9的功能及分子机制研究提供了新的线索。 展开更多
关键词 鼻咽肿瘤 基因 np9 基因表达 CNE1细胞
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NP9蛋白的原核表达及纯化 被引量:1
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作者 刘启才 方嬿 +2 位作者 李晓艳 柳息洪 曾益新 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第23期3556-3558,共3页
目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应(PCR)得到NP9基因的编码区序列,克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和We... 目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应(PCR)得到NP9基因的编码区序列,克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-NP9,SDS-PAGE电泳和Westernblotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达,层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体,该载体能在细菌内表达出GST-NP9融合蛋白,有效分离得到NP9蛋白。 展开更多
关键词 np9蛋白 原核表达 蛋白纯化
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新的人内源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与病毒蛋白表达 被引量:1
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作者 任跃忠 戴巧定 徐荣臻 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第4期361-364,371,共5页
目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统。方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-... 目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统。方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体pQE30中,然后提取质粒,酶切鉴定;最后经IPTG诱导,原核表达重组子在M15宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE与Western印迹分析与鉴定。结果:应用RT-PCR技术,从系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的总RNA中扩增到一条大小约为250bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为NP9基因,具有一个完整的开放阅读框架;将pQE30-NP9重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达NP9重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹技术鉴定证实:在相对分子量约9kD处见明显的病毒特异性的高表达条带。结论:已成功克隆了新的人内源性逆转录病毒NP9基因,并经IPTG诱导,在M15宿主菌中表达了相应的病毒蛋白,为进一步研究该逆转录病毒与自身免疫性疾病的相关性奠定基础。 展开更多
关键词 内源性逆转录病毒 基因 病毒 病毒np9基因 克隆 分子 病毒蛋白表达
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雷公藤甲素通过抑制逆转录病毒HERV-K Np9基因转录诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡 被引量:16
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作者 陈将华 郑维威 +2 位作者 姜旭东 陆晓雅 徐荣臻 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期702-706,共5页
目的探讨雷公藤甲素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡分子机制。方法 MTT检测雷公藤甲素对Jurkat细胞的增殖抑制作用,然后用Origin Pro8计算出IC50。按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度雷公藤甲素处理Jurkat细胞48 h,然后用流式细... 目的探讨雷公藤甲素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡分子机制。方法 MTT检测雷公藤甲素对Jurkat细胞的增殖抑制作用,然后用Origin Pro8计算出IC50。按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度雷公藤甲素处理Jurkat细胞48 h,然后用流式细胞仪检测细胞凋亡变化。用半定量RT-PCR法检测加药处理后各组Np9基因m RNA的表达水平变化并用Kodak 1D 3.6软件对条带进行定量分析。采用统计软件分析Np9转录抑制与细胞凋亡的相关性。Western Blotting检测Np9下游信号分子c-myc,β-catenin,ERK,AKT和Notch1蛋白的变化。结果雷公藤甲素呈剂量依赖性抑制Jurkat细胞的增殖,其IC50为12.7 nmol/L。雷公藤甲素呈剂量依赖诱导Jurkat细胞凋亡。进一步实验研究结果显示,雷公藤甲素呈剂量依赖方式抑制Jurkat细胞中Np9基因的m RNA的转录水平。经统计分析发现Np9转录抑制与细胞凋亡之间具有显著的相关性(R2=0.907)。Western Blotting方法结果发现雷公藤甲素在抑制Np9 m RNA转录同时伴有其下游信号分子c-myc,β-catenin,ERK,AKT和Notch1蛋白表达水平降低。结论下调HERV-K Np9 m RNA及其下游信号分子c-myc,β-catenin,ERK,AKT和Notch1蛋白水平是雷公藤甲素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的重要分子机制之一。 展开更多
关键词 雷公藤甲素 急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞 凋亡 HERV-K np9基因
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人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备
6
作者 刘启才 李晓艳 +1 位作者 彭燕 李冰 《广州医学院学报》 2005年第2期13-15,共3页
目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法:酶切pMD18TNP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrackCMVNP9载体,线性化后与pAdEasy1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pADNP9病毒载体。将重组腺病毒载... 目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法:酶切pMD18TNP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrackCMVNP9载体,线性化后与pAdEasy1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pADNP9病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果:酶切鉴定得到阳性pADNP9重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。结论:成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 复制缺陷型腺病毒 同源重组 np9基因 基因治疗
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NP9基因在鼻咽癌中的表达及对CNE1细胞生长的影响 被引量:8
7
作者 刘启才 李晓艳 +1 位作者 韦拔雄 方嬿 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期1009-1011,共3页
关键词 np9基因 鼻咽癌 基因表达 CNE1细胞生长 恶性肿瘤 流行病学
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NP9基因抑制鼻咽癌细胞成瘤的实验研究 被引量:2
8
作者 刘启才 李晓艳 +1 位作者 韦拔雄 曾益新 《中华肿瘤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期641-644,共4页
目的确定NP9基因的表达对鼻咽癌细胞裸鼠成瘤的影响,并探讨其机制。方法构建NP9基因的真核表达载体,转染重组pR c/CMV2-NP9质粒于鼻咽癌细胞系CNE1和SUNE1,筛选并获得稳定表达NP9基因的细胞克隆CEN1/NP9和SUNE1/NP9。以裸鼠致瘤实验确定... 目的确定NP9基因的表达对鼻咽癌细胞裸鼠成瘤的影响,并探讨其机制。方法构建NP9基因的真核表达载体,转染重组pR c/CMV2-NP9质粒于鼻咽癌细胞系CNE1和SUNE1,筛选并获得稳定表达NP9基因的细胞克隆CEN1/NP9和SUNE1/NP9。以裸鼠致瘤实验确定NP9基因对鼻咽癌细胞成瘤特性的影响;通过免疫组化检测移植瘤中增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(cyc lin D1)的表达。结果大部分转基因的G418抗性克隆能够检测到NP9基因的表达。CNE1/NP9细胞接种裸鼠后的成瘤率为43.8%,明显低于CNE1细胞(66.7%)和CNE1/空载体组(75.0%,P均<0.05)。SUNE1/NP9细胞接种裸鼠后移植瘤的生长速度减慢,第30天时肿瘤体积为(3.88±0.81)cm3,与SUNE1细胞和SUNE1/空载体组差异均有统计学意义(P均<0.05)。CNE1/NP9细胞的移植瘤显示出相对较低的PCNA和cyc lin D1表达水平。结论NP9基因通过下调PCNA和cyc linD1的表达,抑制鼻咽癌细胞的裸鼠成瘤或移植瘤的生长。 展开更多
关键词 np9基因 鼻咽肿瘤 致瘤性 增殖细胞核抗原 细胞周期素D1
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系统性红斑狼疮患者外周血细胞中新的人源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与鉴定 被引量:1
9
作者 戴巧定 徐荣臻 +3 位作者 任跃忠 董庆华 方永明 苏立达 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期303-305,共3页
关键词 系统性红斑狼疮 外周血 逆转录病毒 np9基因 分子克隆 鉴定 自身免疫性疾病
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系统性红斑狼疮患者新的内源性逆转录病毒NP9基因表达及其蛋白功能预(英文)
10
作者 任跃忠 戴巧定 徐荣臻 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期248-250,共3页
目的研究新发现的人内源性逆转录病毒NP9基因在系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者体内表达及其蛋白功能预测。方法逆转录PCR、TA克隆技术和DNA序列测定分离、克隆和分析NP9基因,检测40例SLE患者和48名正常对照的NP9... 目的研究新发现的人内源性逆转录病毒NP9基因在系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者体内表达及其蛋白功能预测。方法逆转录PCR、TA克隆技术和DNA序列测定分离、克隆和分析NP9基因,检测40例SLE患者和48名正常对照的NP9基因表达,借助NCBIBLAST系列分析工具及相应的基因分析软件预测其蛋白功能。结果SLE患者组逆转录病毒NP9基因表达阳性率为77.5%(31/40),明显高于正常对照的8.3%(4/48),P<0.01。NP9基因编码产物由74个氨基酸组成,含有多个细胞核内分布信号,其等电点(pI)为9.59,与SLE患者体内高表达的某些细胞因子具有较高同源性。结论SLE患者存在逆转录病毒NP9基因特异性转录,NP9表达可能与SLE发生发展相关。 展开更多
关键词 系统性红斑狼疮 内源性逆转录病毒 np9 基因表达 蛋白功能 细胞因子
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结缔组织疾病
11
《中国医学文摘(皮肤科学)》 2004年第4期237-244,共8页
关键词 结缔组织疾病 系统性红斑狼疮患者 细胞间黏附分子1 CCR5基因 RANTES C4A零基因 核因子ΚB 相关性分析 np9基因
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Human Endogenous Retroviruses and Hematological Malignant Tumors
12
作者 Tianfu Li Hanping Li +1 位作者 Lin Li Jingyun Li 《Infectious Microbes & Diseases》 2022年第2期56-63,共8页
Human endogenous retrovirus(HERV)gene sequences are remnants of retroviruses that infected the ancestors of humans millions of years ago and were integrated into human chromosomes,accounting for approximately 8%-9%of ... Human endogenous retrovirus(HERV)gene sequences are remnants of retroviruses that infected the ancestors of humans millions of years ago and were integrated into human chromosomes,accounting for approximately 8%-9%of the human genome.Most integrated HERVs have lost their coding capacity and remain silent due to frame shifts,mutations,and sequence deletions or insertions over the millions of years,but their expression is highly regulated by epigenetic and host defense mechanisms.However,there are still some HERV genes that have intact open reading frames due to recent integration into the human genome or positive selective pressure.The abnormal activation of HERVs may contribute to diseases or their pathology,such as malignant tumors,autoimmune diseases,and nervous system diseases.The occurrence and development of hematological malignant tumors(HMTs)is a complex process involving interactions of multiple genetic and environmental factors.The abnormal activation of HERVs may contribute to the pathology of HMTs via indirect mechanisms.In this review,we address the discovery of endogenous retroviruses in vertebrates,and the classification and genomic structure of HERVs.Among HERV family members,HERV-K is the latest type of HERV integrated into the human genome and it has the strongest transcriptional activity.We explore the currently known expression of HERV-K proto-oncogenes in HMTs and further address potential research and therapeutic approaches.However,much remains to be learned about not only the impact of HERVs on the occurrence of HMTs,but also the potential value of HERVs as diagnostic and therapeutic targets for HMTs. 展开更多
关键词 human endogenous retrovirus hematologic malignant tumor np9 gene
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