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新孢子虫NcSAG1与NcSRS2基因的原核表达与纯化 被引量：1
1
作者 史茜 员丽娟 +1 位作者 季新成 于学辉 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1548-1551,1558,共5页
PCR扩增新孢子虫NcSAG1与NcSRS2基因,将其构建至原核表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL-21菌株。对重组表达质粒pET28a/SRS2与pET28a/SAG1IPTG的诱导浓度和诱导温度等条件进行了摸索,确定蛋白最佳诱导时间分别为5、3h,IPTG浓度均为0.8 m... PCR扩增新孢子虫NcSAG1与NcSRS2基因,将其构建至原核表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL-21菌株。对重组表达质粒pET28a/SRS2与pET28a/SAG1IPTG的诱导浓度和诱导温度等条件进行了摸索,确定蛋白最佳诱导时间分别为5、3h,IPTG浓度均为0.8 mmol/L。经组氨酸标记Ni 2+柱纯化后获得的蛋白纯度均大于93.5%,蛋白质量浓度分别为1.23、1.1g/L。经Western blotting检测证明表达的蛋白具有较好的特异性。用纯化后pET28a/SRS2、pET28a/SAG1和二者等量混合物包被酶标板,经ELISA检测表明,表达的蛋白具有较强免疫活性,2种蛋白等量混合物包被酶标板与各蛋白单独包被酶标板检测比较,并未见D值升高。 展开更多
关键词 新孢子虫 ncsag1 NcSRS2 原核表达 WESTERN BLOTTING ELISA
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牛源犬新孢子虫NcSAG1基因重组腺病毒株的构建及动物免疫试验 被引量：1
2
作者 贾立军 张守发 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第22期4705-4712,共8页
【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组... 【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和Westernblotting技术检测Ad5-NcSAG1及其表达蛋白产物。测定Ad5-NcSAG1重组腺病毒滴度后,接种Balb/c小鼠,测定小鼠血清中IgG特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以此评价重组腺病毒株的免疫应答效果。【结果】扩增的牛源犬新孢子虫NcSAG1基因大小为982bp,与GenBank中发表的NcSAG1(AF132217)核苷酸序列的同源性为99.2%;经PCR和Western blotting检测,重组腺病毒Ad5-NcSAG1在QBI-HEK 293细胞中包装成功,表达蛋白的分子量为33kD,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSAG1滴度为1010TCID50/mL,Ad5-NcSAG1接种Balb/c小鼠后,能够诱导产生高水平的IgG特异性抗体和IFN-γ、IL-4细胞因子。说明Ad5-NcSAG1重组腺病毒对Balb/c小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。【结论】成功构建了牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,该毒株能够诱导Balb/c小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,为犬新孢子虫新型疫苗的临床试验奠定了基础。 展开更多
关键词 牛 犬新孢子虫 ncsag1 重组腺病毒 动物免疫
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用重组蛋白NcSAG1t作为ELISA诊断抗原进行改良绒山羊Neospora caninum的血清学诊断 被引量：1
3
作者 陆艳 王戈平 马利青 《中国畜牧兽医》 CAS 2007年第2期109-111,共3页
Ncaninum的表面抗原1(NcSAG1)在建立新孢子虫病的诊断上是一个重要的诊断抗原。为了建立有效的诊断方法,基因编码的截头(NcSAG1t)缺失一个信使缩氨酸和C-末端的疏水性区域的基因,象谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白一样被克隆和表达在esch... Ncaninum的表面抗原1(NcSAG1)在建立新孢子虫病的诊断上是一个重要的诊断抗原。为了建立有效的诊断方法,基因编码的截头(NcSAG1t)缺失一个信使缩氨酸和C-末端的疏水性区域的基因,象谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白一样被克隆和表达在escherichiacoli。纯化的GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原被用在改良绒山羊N caninum抗体的检测中。经过对207份改良绒山羊血清样品进行检测,检出Ncaninum抗体阳性16份,阳性率为7.73%。结果初步说明青海省的改良绒山羊羊群中存在Ncaninum。 展开更多
关键词 N caninum ncsag1t ELISA 改良绒山羊 抗体
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延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因的克隆与序列分析
4
作者 贾立军 张守发 宋建臣 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第1期115-117,共3页
为了解延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因特性,试验提取延边黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA,应用PCR技术扩增延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因,并将此基因克隆到pMD18-TSimple载体上,筛选获得重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中,对PC... 为了解延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因特性,试验提取延边黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA,应用PCR技术扩增延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因,并将此基因克隆到pMD18-TSimple载体上,筛选获得重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中,对PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的菌株进行测序,用DNASIS序列分析软件将目的基因与已发表的核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明:克隆的基因片段长度为681 bp,编码226个氨基酸,与GenBank中发表的NcSAG1基因(AY113004)核苷酸序列同源性为99.7%。 展开更多
关键词 犬新孢子虫 ncsag1基因 克隆 序列分析
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腺病毒穿梭载体介导牛源新孢子虫NcSAG1基因转染293细胞的表达 被引量：1
5
作者 贾立军 张守发 《畜牧与兽医》 北大核心 2011年第3期57-59,共3页
为了解腺病毒穿梭载体介导NcSAG1基因在293细胞中的表达情况,本试验应用PCR技术扩增牛源新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD-18T-NcSAG1克隆质粒和腺病毒重组穿梭质粒pCR259-NcSAG1,将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组质粒转染293细胞,应用免疫荧... 为了解腺病毒穿梭载体介导NcSAG1基因在293细胞中的表达情况,本试验应用PCR技术扩增牛源新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD-18T-NcSAG1克隆质粒和腺病毒重组穿梭质粒pCR259-NcSAG1,将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组质粒转染293细胞,应用免疫荧光试验(IFA)和Western blot技术检测pCR259-NcSAG1重组质粒在293细胞中的表达。结果显示:扩增的牛源新孢子虫NcSAG1基因长度为982 bp,与GenBank中发表的NcSAG1(AF132217)核苷酸序列同源性为99%,IFA检测构建的pCR259-NcSAG1重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,Western blot分析表达蛋白的分子量为33 ku,具有较好的反应原性。本试验为NcSAG1腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 ncsag1基因 腺病毒穿梭载体 293细胞 表达
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牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立 被引量：10
6
作者 金超 贾立军 +4 位作者 曹世诺 栾杨 王娜 李月梅 张守发 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1084-1088,共5页
为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试... 为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×105copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性。表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测。 展开更多
关键词 犬新孢子虫 ncsag1基因 环介导等温扩增
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柴达木地区黄牛新孢子虫病的ELISA检测 被引量：7
7
作者 马利青 《畜牧与兽医》 北大核心 2006年第4期46-47,共2页
牛新孢子虫(N.caninum)感染是一种主要引起妊娠牛发生流产和狗的神经肌肉麻痹的致病病因。N.caninum的表面抗原1(NcSAG1)是一个重要的诊断抗原。为了建立有效的诊断方法,纯化的GST-NcSAG1 t作为ELISA诊断抗原被用在黄牛N.caninum抗体的... 牛新孢子虫(N.caninum)感染是一种主要引起妊娠牛发生流产和狗的神经肌肉麻痹的致病病因。N.caninum的表面抗原1(NcSAG1)是一个重要的诊断抗原。为了建立有效的诊断方法,纯化的GST-NcSAG1 t作为ELISA诊断抗原被用在黄牛N.caninum抗体的检测中。经过对221份柴达木黄牛血清样品进行检测,检出N.caninum抗体阳性35份,阳性率为15.84%,说明青海省柴达木黄牛群中存在N.caninum感染。 展开更多
关键词 N.caninum ncsag1t ELISA 柴达木黄牛 抗体
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新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达 被引量：1
8
作者 卢计委 刘群 汪明 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2007年第12期3-5,共3页
根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双... 根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。 展开更多
关键词 犬新孢子虫 ncsag1-SRS2融合基因 真核表达 转染
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青海省格尔木市乳牛新孢子虫病的血清学调查 被引量：20
9
作者 晁万鼎 马利青 +3 位作者 李文昌 张作秀 李东曲 韩文阁 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第12期1012-1014,共3页
用重组蛋白GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原,对格尔木市乳牛犬新孢子虫病进行了调查。结果,从35份乳牛血清样品中检出犬新孢子虫抗体阳性血清4份,阳性率为11.42%。检测结果说明,青海省格尔木市饲养的乳牛牛群中存在犬新孢子虫感染。
关键词 犬新孢子虫病 重组蛋白 乳牛 血清学调查
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