猪丁型冠状病毒非结构蛋白NSP9和NSP16抑制IFN-Ⅰ的表达

1

作者 刘思雨 赵硕 +10 位作者 欧阳康 何颖 卢冰霞 赵武 段群棚 许心婷 全琛宇 许艺兰 李斌 程珂 秦毅斌 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第1期1-10,共10页

为探究猪丁型冠状病毒(PDCoV)非结构蛋白NSP9和NSP16对宿主细胞Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的调控作用,在293T细胞中过表达NSP9、NSP16,通过双荧光素酶报告系统和qRT-PCR评估NSP9、NSP16对仙台病毒(Se V)诱导产生的IFN-β的影响,再通过q RT-PCR... 为探究猪丁型冠状病毒(PDCoV)非结构蛋白NSP9和NSP16对宿主细胞Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的调控作用,在293T细胞中过表达NSP9、NSP16,通过双荧光素酶报告系统和qRT-PCR评估NSP9、NSP16对仙台病毒(Se V)诱导产生的IFN-β的影响,再通过q RT-PCR、Western-blot检测NSP9、NSP16对RIG-Ⅰ样受体(RLRs)信号通路的影响。结果显示,NSP9、NSP16能显著抑制和降低Se V诱导的IFN-β启动子活性、IFN-β与干扰素刺激基因15(ISG15)的转录水平。同时,过表达NSP9可以显著降低RLRs信号通路中视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3)的转录水平,并显著抑制RIG-Ⅰ、MDA5、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)和TBK1的表达;而过表达NSP16可以显著降低RIG-Ⅰ和MDA5的转录水平,并显著抑制RIG-Ⅰ的表达和IRF3的磷酸化。结果表明,PDCoV的非结构蛋白NSP9和NSP16可能通过调控RLRs信号通路来抑制IFN-Ⅰ产生,为阐明PDCoV的致病机制、寻找新的治疗靶点、开发新型抗病毒药物奠定了理论基础。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 nsp9蛋白 NSP16蛋白 Ⅰ型干扰素

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP9的表达纯化及多克隆抗体的制备

2

作者 刘凯 冯康 +5 位作者 熊江广 王文清 张志榜 李鹏成 张锦华 张晓燕 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第8期108-114,共7页

旨在获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白NSP9及制备PRRSV NSP9的多克隆抗体。本研究应用PCR技术扩增出全长NSP9目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,同时插入His和Flag融合标签,获得重组质粒pET-28a-NSP9;然后将重组... 旨在获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白NSP9及制备PRRSV NSP9的多克隆抗体。本研究应用PCR技术扩增出全长NSP9目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,同时插入His和Flag融合标签,获得重组质粒pET-28a-NSP9;然后将重组质粒转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导并优化诱导温度和时间,SDS-PAGE和Western blot鉴定,观察NSP9蛋白的表达情况,确定NSP9蛋白的最佳表达条件,应用镍柱亲和层析纯化NSP9蛋白;最后将纯化后的NSP9蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体反应原性。结果:含有pET-28a-NSP9重组质粒的大肠杆菌,在IPTG终浓度为0.2 mmol/L诱导,16℃培养32 h的条件下,NSP9蛋白主要以可溶性形式表达,经镍柱亲和层析纯化成功获得高纯度的NSP9蛋白,经间接ELISA和Western blot测定成功获得特异性的NSP9多克隆抗体。综上,本研究以全长NSP9基因为模板,克隆转化后表达出72 kDa左右的可溶性重组蛋白,利用其作为抗原免疫制备的抗PRRSV多克隆抗体具备良好的生物活性,为后续PRRSV检测、免疫血清诊断试剂的研发及研究PRRSV NSP9的生物学功能奠定了重要基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体

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新冠非结构蛋白nsp9细胞定位及其与宿主蛋白互作分析

3

作者 张倡珲 代玉涵 +2 位作者 王应归 王美林 赵一洋 《陕西师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期94-101,共8页

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)对人类健康及社会经济结构造成了深远且严重的冲击,剖析该病毒复制机制的核心环节对制定有效的SARS-CoV-2防控策略尤为重要。新冠非结构蛋白nsp9是一种关键单链核酸结合蛋白,在病毒生命循环中... 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)对人类健康及社会经济结构造成了深远且严重的冲击,剖析该病毒复制机制的核心环节对制定有效的SARS-CoV-2防控策略尤为重要。新冠非结构蛋白nsp9是一种关键单链核酸结合蛋白,在病毒生命循环中扮演着举足轻重的角色。通过在细胞中过表达融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的nsp9,再利用激光共聚焦显微镜观察发现,nsp9主要定位于细胞核。采用免疫沉淀联合质谱分析初步鉴定出nsp9与包括YWHAB、TRAF2在内的多个细胞内蛋白存在相互作用,并利用免疫共沉淀及pull-down实验进行了验证。此外,通过CCK8细胞活力检测、EdU细胞增殖实验以及TUNEL细胞凋亡实验等方式探究nsp9对宿主细胞生物学特性的潜在影响,发现nsp9过表达并不能显著影响细胞正常增殖或诱导细胞凋亡。研究结果为后续深入探究nsp9与宿主蛋白的互作关系及其在SARS-CoV-2感染中的分子机制提供了一定参考。 展开更多

关键词 SARS-CoV-2 非结构蛋白 nsp9 互作蛋白

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达 被引量：5

4

作者 沈张奇 郭鑫 +3 位作者 杨汉春 盖新娜 陈艳红 查振林 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2007年第10期3-5,共3页

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组... 通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白 nsp9基因 克隆 原核表达

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针对nsp9基因的siRNA在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响 被引量：3

5

作者 赵孟孟 李华玮 +4 位作者 何健 冯松林 张雅 张二芹 张桂红 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1648-1652,1669,共6页

为了验证猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp9基因对PRRSV的复制影响,化学合成针对nsp9基因的siRNA,转染到Marc-145细胞中,接种PRRSV之后分别通过荧光定量和Western blot方法来测定病毒的滴度变化和表达情况。结果发现,转染siRNA的Marc-... 为了验证猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp9基因对PRRSV的复制影响,化学合成针对nsp9基因的siRNA,转染到Marc-145细胞中,接种PRRSV之后分别通过荧光定量和Western blot方法来测定病毒的滴度变化和表达情况。结果发现,转染siRNA的Marc-145细胞中病毒的滴度低于未转染特定siRNA的对照组,同时N蛋白的mRNA和蛋白水平均低于未转染特定siRNA的对照组。初步得出结论nsp9基因为病毒复制关键基因,针对nsp9基因的siRNA会在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9 复制 SIRNA 滴度

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定 被引量：3

6

作者 赵孟孟 张二芹 +5 位作者 冯松林 郭依嘉 阮海宇 王文佳 邢星 张桂红 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期63-69,共7页

根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂... 根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂交瘤细胞阳性克隆筛选,2次亚克隆后共获得3株抗PRRSV NSP9单克隆抗体,命名为3B17、3J13、3F19。这3株单抗可与大肠杆菌表达的蛋白产物和PRRSV感染的Marc-145细胞发生特异性反应。在PRRSV感染的Marc-145细胞中,NSP9蛋白表达水平接毒后不断升高,48 h达最高,为深入研究NSP9功能奠定基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9 单克隆抗体 杂交瘤

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猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析 被引量：4

7

作者 赵孟孟 宋中宝 +4 位作者 冯松林 王文佳 邢星 冯嘉萍 张桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第9期2249-2256,共8页

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基... 为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%~98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9基因 克隆 序列分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达 被引量：2

8

作者 吴锦艳 田宏 +3 位作者 陈妍 尚佑军 刘湘涛 吴润 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期843-847,共5页

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆... 为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9基因 绿色荧光蛋白 融合表达

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Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化 被引量：3

9

作者 赵孟孟 冯松林 +3 位作者 王文佳 邢星 冯嘉萍 张桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第10期2534-2540,共7页

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSV Nsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR Green... 试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSV Nsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×104~1×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR nsp9基因

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测 被引量：2

10

作者 赵孟孟 冯丽丽 +9 位作者 张二芹 马红芳 冯松林 崔甜甜 杨春辉 王文佳 邢星 张雅 冯嘉萍 张桂红 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2016年第12期138-142,共5页

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检... 为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9蛋白 真核表达 亚细胞定位

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猪繁殖与呼吸综合征病毒强、弱毒株Nsp9基因的反向遗传学替换改造 被引量：2

11

作者 赵孟孟 钱娟娟 +5 位作者 崔甜甜 冯松林 王文佳 邢星 冯嘉萍 张桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第11期2852-2858,共7页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。为了探索Nsp9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性,本研究利用反向遗传学... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。为了探索Nsp9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性,本研究利用反向遗传学技术将PRRSV弱毒疫苗毒CH-1R的Nsp9基因进行克隆,酶切后连接到强毒株XH-GD的感染性克隆上,进行病毒的拯救。结果表明,成功构建替换了CH-1RNsp9基因的重组病毒。对重组病毒的生物学特性研究发现,拯救病毒的生长速度和病毒滴度明显高于亲本毒株rXH-GD,但是低于疫苗毒CH-1R,重组毒株的噬斑大小与CH-1R相似,初步推测疫苗株CH-1R的聚合酶有助于提高病毒的滴度。本试验为进一步研究Nsp9基因对病毒毒力的影响奠定基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9基因 反向遗传学 病毒拯救

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PRRSV强、弱毒株Nsp9基因对PRRSV复制的影响 被引量：1

12

作者 赵孟孟 冯丽丽 +7 位作者 冯松林 马红芳 张二芹 王文佳 邢星 张雅 冯嘉萍 张桂红 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期15-20,共6页

为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强、弱毒株的Nsp9基因对PRRSV复制的影响,构建含有PRRSV XH-GD强毒株、CH-1R弱毒株Nsp9全长基因的质粒p IRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD、p IRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R,并将重组质粒分别转染到Marc-145细胞中,... 为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强、弱毒株的Nsp9基因对PRRSV复制的影响,构建含有PRRSV XH-GD强毒株、CH-1R弱毒株Nsp9全长基因的质粒p IRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD、p IRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R,并将重组质粒分别转染到Marc-145细胞中,以MOI=1的剂量接种PRRSV XH-GD毒株,通过TCID50试验测定病毒的滴度,采用荧光定量PCR和Western Blot方法来测定病毒的N蛋白表达情况。结果表明,转染弱毒株CH-1R Nsp9基因的Marc-145细胞中,PRRSV的N蛋白在mRNA水平、蛋白质水平上的表达量均高于转染强毒株XH-GD组,且病毒的滴度也显著高于转染强毒株XH-GD组。综上,在Marc-145细胞中,弱毒株CH-1R Nsp9基因对PRRSV复制的促进作用优于强毒株XH-GD。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9基因 复制 病毒滴度

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抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定 被引量：1

13

作者 吴娟 王潇博 +2 位作者 黄志强 杨闽楠 丁壮 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第9期1180-1184,共5页

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Wes... 目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。 展开更多

关键词 猪呼吸与生殖综合征病毒 nsp9蛋白 单克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白与RACK1蛋白相互作用的研究 被引量：1

14

作者 郭东伟 尹曼曼 +4 位作者 张枫 李江南 黄丽 余丽芸 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期259-262,共4页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)编码的非结构蛋白NSP9为参与病毒复制的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),而宿主蛋白与RdRp相互作用参与病毒基因组的复制机理尚不明确。为筛选与RdRp相互作用的宿主蛋白,本研究以PPRSV NSP9蛋白为"诱饵&quo... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)编码的非结构蛋白NSP9为参与病毒复制的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),而宿主蛋白与RdRp相互作用参与病毒基因组的复制机理尚不明确。为筛选与RdRp相互作用的宿主蛋白,本研究以PPRSV NSP9蛋白为"诱饵",利用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞cDNA酵母表达文库,筛选结果显示PRRSV NSP9蛋白与宿主蛋白RACK1具有相互作用关系。进一步经酵母共转化试验和免疫共沉淀试验验证RACK1和NSP9特异性结合,并共定位于细胞浆中。研究结果表明,宿主蛋白RACK1是PRRSV NSP9蛋白的一种新的相互作用蛋白,然而RACK1参与PRRSV复制的详细机理有待深入研究。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪肺泡巨噬细胞表达文库 nsp9 RACK1蛋白 蛋白相互作用

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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9基因第642位氨基酸突变对病毒复制的影响 被引量：1

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作者 李华玮 姬鹏超 +3 位作者 王永芬 赵绪永 何健 赵孟孟 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2018年第3期11-14,19,共5页

为了探索Nsp9基因上与病毒复制相关的关键氨基酸位点,通过融合PCR方法突变第642位氨基酸,之后进行病毒的拯救,并对病毒的滴度进行测定。结果表明,突变第642位氨基酸之后可以成功拯救病毒,突变毒株的滴度与亲本毒株的滴度未有明显差异,... 为了探索Nsp9基因上与病毒复制相关的关键氨基酸位点,通过融合PCR方法突变第642位氨基酸,之后进行病毒的拯救,并对病毒的滴度进行测定。结果表明,突变第642位氨基酸之后可以成功拯救病毒,突变毒株的滴度与亲本毒株的滴度未有明显差异,但突变毒株的转录水平有所下降。初步得出结论:猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9基因第642位氨基酸与病毒滴度无关,与病毒转录相关。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9基因 反向遗传学 病毒拯救 642位氨基酸

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PRRSV XH-GD株NSP9缺失感染性克隆的构建 被引量：1

16

作者 赵孟孟 冯丽丽 +3 位作者 冯嘉萍 冯松林 王文佳 张桂红 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第12期10-13,295,共5页

PRRSV的非结构蛋白NSP9是病毒的一种高度保守的非结构蛋白,为了研究病毒NSP9基因是否为病毒复制所必需基因,将PRRSV XH-GD株的NSP9基因通过融合PCR方法进行缺失,将缺失NSP9基因的感染性克隆转染BHK细胞并进行病毒的拯救。结果表明:不能... PRRSV的非结构蛋白NSP9是病毒的一种高度保守的非结构蛋白,为了研究病毒NSP9基因是否为病毒复制所必需基因,将PRRSV XH-GD株的NSP9基因通过融合PCR方法进行缺失,将缺失NSP9基因的感染性克隆转染BHK细胞并进行病毒的拯救。结果表明:不能进行有效的拯救,对照组可以成功拯救。说明NSP9基因的缺失对病毒产生致死的影响,而不是操作手段的问题导致无法成功拯救。 展开更多

关键词 PRRSV nsp9 缺失构建 复制 感染性克隆 拯救

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靶向抑制PRRSV复制的Nsp9/shRNA的筛选及干扰

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作者 吴锦艳 田宏 +3 位作者 陈妍 王光祥 尚佑军 张志东 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期14-20,共7页

RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,使机体具有抗病毒的功效,本试验针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp9基因设计多对shRNA序列,并从细胞水平验证其干扰效果,从中筛选可以使Nsp9基因沉默的优势shRNA序列。利用BLOCK-iTTM R... RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,使机体具有抗病毒的功效,本试验针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp9基因设计多对shRNA序列,并从细胞水平验证其干扰效果,从中筛选可以使Nsp9基因沉默的优势shRNA序列。利用BLOCK-iTTM RNAi Designer软件设计并合成shRNA对应的DNA序列-ds Oligo,构建入门载体pENTR/U6/shRNA;采用共转染技术,经荧光显微镜观察、流式细胞仪检测及Real-time RT-PCR分析等方法筛选优势干扰序列。结果显示:成功构建的6对pENTR/U6/Nsp9-shRNA均具有抑制Nsp9基因表达的效果,其中pENTR/U6/Nsp9-4和pENTR/U6/Nsp9-6的抑制效果更为突出,同时成功构建1对无意义对照pENTR/U6/con-shRNA。结果表明:pENTR/U6/Nsp9-4和pENTR/U6/Nsp9-6两株优势干扰序列的成功筛选可为构建具有干扰PRRSV复制效果的稳定细胞系以及靶向PRRSV的siRNA的转基因动物提供素材。 展开更多

关键词 PRRSV nsp9/shRNA RNA干扰 筛选

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猪繁殖和呼吸综合征病毒HuN4株nsp9、nsp10、nsp11对毒力影响的研究

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作者 姜一峰 周艳君 +5 位作者 王亚欣 朱建平 虞凌雪 徐彦召 童武 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 2011年第6期1-6,共6页

为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧... 为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧光鉴定拯救的重组病毒,分别命名为rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10、rHuN4-F112-nsp11,测序证实HuN4强毒nsp9、nsp10、nsp11片段正确替换入HuN4-F112骨架。拯救病毒在Marc-145细胞上的生长曲线显示,rHuN4-F112-nsp9和rHuN4-F112-nsp10在前24 h的复制速度明显高于rHuN4-F112-nsp11和拯救的母源毒rHuN4-F112,36 h后无明显差别。将拯救病毒以105TCID50剂量接种仔猪,对体温、临床症状、病毒血症、组织器官病变情况进行观察和检测。结果显示,拯救病毒rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112 nsp10、rHuN4-F112 nsp11在致病性、发热以及病毒血症强度上与rHuN4-F112无显著差异,提示单独nsp9、nsp10、nsp11对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒 nsp9 nsp10 nsp11

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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9与宿主CALM2基因编码钙调蛋白的相互作用研究 被引量：1

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作者 胡亮 郭东伟 +3 位作者 李江南 尹曼曼 黄丽 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期674-678,共5页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白Nsp9为该病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp),在病毒的转录复制过程中发挥关键性作用。为筛选与Nsp9相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交方法,以PRRSV Nsp9为诱饵蛋白,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白Nsp9为该病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp),在病毒的转录复制过程中发挥关键性作用。为筛选与Nsp9相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交方法,以PRRSV Nsp9为诱饵蛋白,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)酵母表达c DNA文库中筛选到CALM2(Calmodulin 2)基因。酵母回返验证试验和免疫共沉淀(Co-IP)试验证明CALM2基因编码的钙调蛋白(Ca M)与Nsp9特异地相互作用。激光共聚焦试验表明Ca M与Nsp9共定位于HEK293细胞胞浆内。本研究筛选到一个与Nsp9相互作用的新宿主蛋白Ca M,但该蛋白是否直接参与PRRSV的复制过程还有待进一步研究。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9 酵母双杂交 肺泡巨噬细胞 钙调蛋白

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猪繁殖与呼吸综合征病毒JL07SW株Nsp9基因的序列分析及原核表达 被引量：1

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作者 黄志强 张学东 +2 位作者 丁壮 张泉鹏 宣华 《内蒙古农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2011年第1期7-12,共6页

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株及变异毒株(HB-1、SY0608、HN-HW、HuN4等)的核苷酸序列,利用Primer软件设计合成针对PRRSV Nsp9基因保守区域的特异性引物。用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段,克隆到pM... 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株及变异毒株(HB-1、SY0608、HN-HW、HuN4等)的核苷酸序列,利用Primer软件设计合成针对PRRSV Nsp9基因保守区域的特异性引物。用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,基因克隆至表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28a-Nsp9,转化BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为34.8 kD,表达量占菌体蛋白的40.32%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步制备抗Nsp9单抗及建立区分野毒和灭活毒感染的ELISA方法提供物质基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp9基因 克隆序列分析 原核表达

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