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GST-hMunc18-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
1
作者 吴怡 王婧 王岚 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期557-561,共5页
目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMu... 目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMunc18-1。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在E.coli BL21大肠杆菌中诱导GST-hMunc18-1融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western Blot鉴定结果。结果:hMunc18-1编码序列克隆至pGEX-6p-1载体中,双酶切鉴定片段大小为1785 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为67 000 Da,成功纯化出GST及GST-hMunc18-1蛋白,Western Blot检测到蛋白表达。结论:成功地构建了hMunc18-1基因原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化Munc18-1及研究其结构与功能奠定了基础。 展开更多
关键词 munc18-1 蛋白纯化 融合蛋白
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人类Munc18-1重组质粒的构建及蛋白表达和定位
2
作者 吴怡 王婧 +1 位作者 王岚 杨卫静 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 CAS 2015年第6期430-433,共4页
目的构建人类Munc18-1(hMunc18-1)真核表达质粒pEGFP-hMunc18-1并检测其融合蛋白GFPhMunc18-1在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板,聚合酶链反应PCR扩增hMunc18-1全长编码基因,亚克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEG... 目的构建人类Munc18-1(hMunc18-1)真核表达质粒pEGFP-hMunc18-1并检测其融合蛋白GFPhMunc18-1在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板,聚合酶链反应PCR扩增hMunc18-1全长编码基因,亚克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。将构建的重组质粒pEGFPhMunc18-1送到Invitrogen公司进行基因测序,根据NCBI数据库中的hMunc18-1基因序列判断所得重组质粒的基因序列是否正确。将测序正确的质粒pEGFP-hMunc18-1转染到非洲绿猴肾细胞COS-7细胞中,提取细胞蛋白以Western blot法检测融合蛋白GFP-hMunc18-1表达,利用共聚焦激光扫描显微镜观察其在非洲绿猴肾细胞COS-7内的定位。结果 hMunc18-1全长基因序列被成功克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切后鉴定其片段大小为1785bp。Western blot检测到融合蛋白GFP-hMunc18-1相对分子质量约为94 000,主要分布在细胞质,尤其是细胞膜附近。结论成功构建了hMunc18-1全长基因真核表达质粒pEGFPhMunc18-1,其融合蛋白GFP-hMunc18-1主要定位于COS-7细胞质内,尤其是细胞膜附近。 展开更多
关键词 munc18-1 WESTERN BLOT 绿色荧光蛋白 质粒构建
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年龄、性别对封闭群小鼠脑内Munc18-1含量及血清甲状腺激素水平的影响 被引量：2
3
作者 曹磊 陈贵海 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2012年第12期1407-1407,共1页
目的①探讨年龄、性别对封闭群小鼠(KM、ICR)不同脑区Munc18-1含量的影响;②探讨年龄、性别对封闭群小鼠(KM、ICR)血清甲状腺激素水平的影响;③探讨Munc18-1含量与血清甲状腺激素水平之间的相关性。方法①选取3个年龄段(22月龄老年组、1... 目的①探讨年龄、性别对封闭群小鼠(KM、ICR)不同脑区Munc18-1含量的影响;②探讨年龄、性别对封闭群小鼠(KM、ICR)血清甲状腺激素水平的影响;③探讨Munc18-1含量与血清甲状腺激素水平之间的相关性。方法①选取3个年龄段(22月龄老年组、11月龄中年组、6月龄青年组)昆明小鼠和2个年龄段(12月龄中年组、7月龄青年组)ICR小鼠;②应用Western blot检测小鼠嗅球、额叶、顶叶、腹侧海马及背侧海马中Munc18-1和内参蛋白β-actin蛋白的表达。Munc18-1灰度值与β-actin灰度值的比值作为Munc18-1相对含量;②采用放射免疫法检测小鼠血清甲状腺激素水平;③用方差分析、Spearman秩相关检验进行统计学分析。结果①22月龄昆明小鼠背侧海马Munc18-1含量显著高于中年鼠和青年鼠(P<0.05),且以老年雌鼠显著(P<0.05),而中年昆明小鼠与青年鼠之间未发现显著性差异(P>0.05);12月龄ICR小鼠背侧海马Munc18-1相对含量显著高于青年鼠(P<0.05),且以雌鼠显著(P<0.05)。②22月龄昆明小鼠血清FT3、FT4水平显著低于青年鼠(P<0.05),且FT3显著低于中年鼠(P<0.05),以雌鼠显著(P<0.05),而中年与青年鼠之间未发现显著性差异(P>0.05);12月龄ICR小鼠血清FT3水平显著低于青年鼠(P<0.05),以雌鼠显著(P<0.05)。③昆明小鼠和ICR小鼠背侧海马Munc18-1含量均与FT3呈负相关(P<0.05)。结论①封闭群小鼠背侧海马Munc18-1含量可出现年龄相关性显著升高,其中以雌鼠升高更明显;②封闭群小鼠可出现年龄相关性血清甲状腺激素水平显著降低,其中以雌鼠降低更明显;③血清甲状腺激素水平降低可能是导致背侧海马Munc18-1含量升高的原因之一。 展开更多
关键词 衰老 小鼠 学习和记忆 munc18-1 甲状腺激素
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突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达
4
作者 宋锐 顾翔 +1 位作者 陈知己 袁伟 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期439-442,共4页
目的研究突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的表达及定位。方法应用激光共聚焦成像技术,通过免疫荧光单标法检测Munc18-1蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞中的表达,免疫荧光双标法检测其与带状突触蛋白Ct BP2的定位关系。结果通过激光... 目的研究突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的表达及定位。方法应用激光共聚焦成像技术,通过免疫荧光单标法检测Munc18-1蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞中的表达,免疫荧光双标法检测其与带状突触蛋白Ct BP2的定位关系。结果通过激光共聚焦成像技术检测发现,免疫荧光单标染色显示内毛细胞胞质中有高浓度的Munc18-1蛋白表达,免疫荧光双标染色结果显示Munc18-1蛋白聚集在Ct BP2蛋白附近。结论 Munc18-1蛋白在耳蜗内毛细胞中有表达,聚集在突触蛋白Ct BP2周围,可能与维持突触囊泡融合、胞吐功能紧密相关。 展开更多
关键词 munc18-1蛋白 CT BP2蛋白 突触囊泡 内毛细胞
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Munc13-1、Munc18-1对锰染毒SH-SY5Y细胞中多巴胺分泌障碍的影响 被引量：2
5
作者 李昌哲 于春 +2 位作者 赵华 李军 胡婷 《环境与职业医学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期268-272,共5页
[背景]慢性锰中毒诱发神经递质分泌障碍一直是其造成机体损伤的重要原因之一,但锰致神经递质分泌障碍的机制目前并不清楚。[目的]探究突触前膜胞内蛋白13-1(Munc13-1)与突触融合蛋白结合蛋白18-1(Munc18-1)对氯化锰(MnCl_(2))致人神经... [背景]慢性锰中毒诱发神经递质分泌障碍一直是其造成机体损伤的重要原因之一,但锰致神经递质分泌障碍的机制目前并不清楚。[目的]探究突触前膜胞内蛋白13-1(Munc13-1)与突触融合蛋白结合蛋白18-1(Munc18-1)对氯化锰(MnCl_(2))致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)多巴胺(DA)分泌障碍的影响。[方法]建立MnCl_(2)诱导SH-SY5Y细胞模型,根据MTT法测细胞存活率,实验分组为对照组和低、中、高浓度染锰组(0、100、200、400μmol·L^(−1)MnCl_(2)),处理24 h。用酶联免疫吸附试验试剂盒测定培养基中DA分泌量。通过实时荧光定量PCR检测细胞突触融合蛋白-1(Syntaxin-1)mRNA表达水平。提取细胞总蛋白,采用Western blotting检测Munc13-1、Munc18-1以及Syntaxin-1蛋白表达水平。并对MnCl_(2)染毒浓度和DA分泌量与Munc13-1、Munc18-1蛋白表达量之间做Pearson相关性分析。[结果]与对照组比较,随着锰染毒浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,中、高浓度染锰组差异具有统计学意义(P<0.05);各锰染毒组细胞培养液中DA浓度随锰浓度增加呈下降趋势,与对照组和低浓度染锰组比,中、高浓度染锰组差异具有统计学意义(P<0.05);Syntaxin-1的表达量在mRNA和蛋白层次上,在各组间变化不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,Munc13-1的蛋白表达量随染锰浓度增加而依次下降,Munc18-1的蛋白表达量依次上升(P<0.05),其中与低浓度染锰组相比,高浓度染锰组Munc13-1和中、高浓度染锰组Munc18-1蛋白变化有统计学意义(P<0.05),与中浓度染锰组比,高浓度染锰组Munc18-1蛋白变化有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,MnCl_(2)染毒浓度与Munc13-1蛋白表达呈负相关(r=-0.898,P<0.05),与Munc18-1蛋白表达呈正相关(r=0.678,P<0.05);DA浓度与Munc13-1蛋白表达呈正相关(r=0.932,P<0.05),与Munc18-1蛋白表达呈负相关(r=-0.817,P<0.05)。[结论]锰染毒SH-SY5Y细胞致DA的分泌抑制,与其上调Munc18-1和下调Munc13-1蛋白的表达水平有关,这可能是锰致神经损伤的原因之一。 展开更多
关键词 锰 SH-SY5Y细胞 多巴胺 突触前膜胞内蛋白13-1 突触融合蛋白结合蛋白18-1
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Syntaxin-1蛋白的多重功能(英文) 被引量：2
6
作者 孙坚原 Thomas C Südhof 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期821-827,共7页
Syntaxin-1是特异性地分布在神经细胞突触前质膜上的蛋白。它早期被作为分子量为35 kD的synaptotagmin-1结合蛋白,但很快就被认识到是细胞质膜融合的关键蛋白。Syntaxin-1通过与SNAP25和Synaptobrevin/VAMP蛋白聚合,进而形成被认为是神... Syntaxin-1是特异性地分布在神经细胞突触前质膜上的蛋白。它早期被作为分子量为35 kD的synaptotagmin-1结合蛋白,但很快就被认识到是细胞质膜融合的关键蛋白。Syntaxin-1通过与SNAP25和Synaptobrevin/VAMP蛋白聚合,进而形成被认为是神经突触囊泡融合必要因子的SNARE核心复合体。作为一个多结构域的蛋白,syntaxin-1与多个突触蛋白相互作用,其作用远超出了仅作为SNARE核心复合体中一个蛋白质成员的作用。本文着重介绍了有关syntaxin-1与其它SNARE组份蛋白、munc18蛋白和钙离子通道的相互作用及其功能的最新研究进展。全面揭示syntaxin-1作为SNARE核心复合体成员的功能以及超越这一功能的作用,还有待于对其结构以及与其它突触蛋白相互作用特性的进一步深刻理解。 展开更多
关键词 SYNTAXIN 1蛋白 munc18-1蛋白 钙离子通道 囊泡融合 囊泡促成熟 complexin蛋白 synaptotagmin蛋白
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